酵母双杂交点对点
▼服务简介
酵母双杂交由 Fields 和 Song 在 1989 年提出. 他的产生是基于对真核细胞转录因子特别是酵母转录因子 GAL4 性质的研究。酵母双杂交就是基因转录所需的转录因子的两个结构域在两个互作蛋白的吸引下位置靠近，诱导了基因的表达。酵母双杂交及系统是一种鉴定和检测蛋白质相互作用的研究方法，因其具有灵敏性高、功能强大、适用范围广等特点。
▼应用场景
酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用，及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。
▼实验原理
酵母双杂交系统是在酵母体内通过重建有活性转录因子的结构来鉴定蛋白质之间的相互作用。转录因子可以和 DNA 上特异的序列结合而启动相应基因的转录。这种 DNA 结合与转录激活的功能是由转录因子上两个相互独立的结构域即 DNA 结合结构域 (Binding Domain, BD) 和转录激活结构域 (Activation Domain, AD) 分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录激活都是必须的。在 GAL4 系统中利用转录因子 GAL4 的 DNA 结合结构域 GAL4-BD 与激活结构域 GAL4-AD 的特异载体，分别与基因的 ORFs 融合，转化酵母细胞。在酵母内表达的蛋白若发生相互作用时，就会将 GAL4-BD 和 GAL4-AD 结合在一起，从而与上游激活序列 (upstream activating sequence, UAS) 结合，激活相应报告基因的表达，在相应的营养缺陷型培养基上筛选阳性。酵母双杂交（点对点），最终结果是确定候选的蛋白质-蛋白质是否存在相互作用。
▼服务内容
▼案例展示
▼常见问题
1.Clontech 文库是否可行？
clontech 和 invitrogen 体系是两家公司的产品，分别用的是 SMART 和 Gateway 重组方法。判定文库质量有 3 个标准，库容，重组率，平均插入片段大小。clontech 体系存在很多技术上的弊端，现在已经慢慢被淘汰了。比如合成 cDNA 第二链时用的是 PCR 方法，一个物种一般有几万个基因，用一种酶把几万个基因全部扩增到是很难实现的，就像我们平时克隆一个基因经常出现有的酶可以 PCR 扩增到，有的酶扩不到。而且 PCR 循环数越多，高拷贝和易扩增的基因冗余度越高，低拷贝和不易扩增的基因慢慢就会丢失，所以很难反映一个物种中基因的真实情况。而 invitrogen 体系在合成 cDNA 第二链时是以第一链为模板，通过 E.coli.DNA Ligase，E.coli.DNA Polymerase I，T4 DNA Polymerase 等不同酶扩增，能够忠实反映第一链的情况，也就是能够忠实反映 mRNA 的情况，保证 mRNA 没有降解，文库构建已经成功一半了。不会造成基因冗余和不均一化的情况。另外由于 clontech 合成 cDNA 第二链是 PCR 的方法，PCR 扩增的局限性导致平均插入片段长度较短，一般在 500bp 左右，这 500bp 可能包括一部分 CDS 和 UTR，甚至全部都是 UTR。如果筛库筛到了，可能就是假阳性，完全没有编码蛋白。invitrogen 体系平均插入片段大于 1kb，大大减少了全部是 UTR 的状况，降低了假阳性。clontech 体系是线性化质粒一步重组，而 invitrogen 体系是环装质粒两步重组，线性化质粒的重组率是低于环装质粒的，所以 clontech 建库后会发现空载率比较高。而环装质粒重组效率高，另外在质粒上加了致死基因，空质粒不会在大肠 DH10B 中生长，大大降低了空质粒情况。综上，invitrogen 体系在库容，重组率，平均插入片段大小方面表现都是优于 clontech 体系。
2. 为什么有的 clontech 体系平均插入片段大于 1kb？
正常做是不容易达到的，因为 PCR 第二链会导致片段小。在 cDNA 分级分离这一步不采用过柱的方法，直接跑胶切下 1kb 或 1.5kb 以上的片段往下重组。这种方法提高了片段大小，但是降低了库容。而 invitrogen 体系不需要这么做，片段较大，直接过柱除去大部分 400-500bp 小片段就可以了。
3. 酵母双杂交筛库用三缺是否可行？
空 AD 和空 BD 质粒共转三缺都会长克隆，这么做筛库会造成很高的假阳性。不过确实可以光速交付结果。
4. 酵母单杂交筛库高通量测序是否可行？
酵母单杂交筛库长出的单克隆，正常操作是直接 PCR，单条带且片段较大的送测序。多条带的一般舍弃不用，无法确定哪个是结合蛋白，同时作用还是单独作用（通过划线分离出单条带的单克隆是可行的，但是很繁琐，单杂长的克隆较多，一般没必要在多条带的单克隆上纠结）。而高通量测序无法分辨测序结果是单条带或多条带的单克隆，继而造成假阳性偏高。