慢性中性粒细胞白血病

【流行病学】

慢性中性粒细胞白血病 (chronic neutrophilic leukemia，CNL) 是一种以骨髓和外周血成熟中性粒细胞克隆性增殖为特征的骨髓增殖性肿瘤 (myelopmlifemtive neoplasm，MPN)。CNL 的发病率极低，目前文献已报道 200 余例，仅有约 150 例报道满足现在的诊断标准，且多为零散报告。CNL 常见于中老年人群，在已报道的病例中，中位发病年龄为 66 岁，男女比例为 1.6:1^[1]。

【一般资料】

患者，男，55 岁，汉族。急性起病，病程较长。11 年前出现反复发热，体温最高达 39℃，在当地医院予以抗感染等治疗，持续 1 月后可恢复正常，此后每年出现持续性发热 1-2 次，每次持续 1 月左右，未有改善；9 年前因「发热 2 周」而就诊，血常规示白细胞 19.03×10⁹/L，红细胞计数正常，血小板计数 464×10⁹/L，血沉及 CRP 显著升高、铁蛋白大于 594ug/L，骨穿示骨髓有核细胞增生活跃，以粒系、巨核系为主，粒系有成熟障碍，部分伴退行性变，部分血红蛋白充盈不足，铁染色示铁利用障碍，单核细胞、浆细胞仍较易见，并可见少量异形淋巴细胞。PET-CT 示骨髓弥漫性 FDG 代谢增高，脾大，纵膈内主动脉弓旁淋巴结反应性增生，遂考虑「成人 Still 病」，建议激素治疗，患者拒绝。2016 年开始环孢素、雅美罗、他克莫司，同时口服甲氨蝶呤片治疗，期间白细胞持续高于 10×10⁹/L。2 月前活动后出现胸闷、心悸，伴双下肢足背延伸胫前，活动后胸闷气促较前加重，至我院急诊就诊。

查体：T36.0℃，P80bpm，R20bpm，BP120/80 mmHg。重度贫血面容，右眼结膜下出血苍白，双眼睑结膜苍白，双侧上肢可见分布不均匀的瘀斑。脾脏齐脐。

血常规：WBC116.16×10⁹/L、Hb53 g/L、PLT45×10⁹/L。

生化：高钙肌敏蛋白 I(cTnI)0.167ug/L，BNP191pg/ml，肌酐 124umol/L,，尿酸 842umol/L，维生素 B12>2000pg/mL，铁蛋白 >2000ug/L，叶酸 5.60ng/L。

免疫：自身抗体谱阴性，类风湿因子、抗「o」检查正常，血小板抗体检测阴性，Coombs 试验阴性。

凝血功能：凝血酶原时间 15.5s，凝血酶原时间国际标准化比值 1.23，纤维蛋白原 4.59 g/L，血浆 D-二聚体 1.90ug/mL，其余正常。

微生物检查：痰培养草绿色链球菌阳性

心电图：窦性心动过速

超声：脾大，双声慢性肾病改变，左肾慢性肾病改变，左肾囊肿，左侧甲状腺结节，甲状腺回声不均。双侧股、腘动脉内膜毛糙、内中膜增厚伴细小斑块形成，双侧股静脉内径正常，管腔通畅，未见明显血栓形成。

胸部 CT 平扫：双肺广泛渗出，双侧胸腔少量积液，左肺下叶局部肺不张，较前片进展，较前片升主动脉壁内血肿有吸收，脾大，脾梗死可能大。

【MICM 结果】

骨髓细胞形态学：

骨髓涂片检查：有核细胞增生明显至极度活跃。粒系增生极度活跃，占 78%，其中原始及早幼粒细胞分别占 2% 及 6%，以中、晚幼及成熟阶段粒细胞（32.5%）为主，各阶段粒细胞颗粒增多增粗。嗜酸性粒细胞比例增高，占 10.5%；红系增生受抑制，占 13.5%；成熟红细胞形态大致正常；淋巴细胞占 4.5%，形态大致正常；全片见巨核细胞 25 个，以过渡及成熟阶段为主，血小板散在可见；铁染色：+++ 内铁：72%。外周血中性粒细胞比例增高（占 87.5%）伴颗粒增多，并可见幼粒（占 3.5%）及原始细胞（占 3%）； 碱性磷酸酶染色呈强阳性。

骨髓穿刺组织病理检查：有核细胞高度增生充满骨髓腔，粒系细胞高度增生，形态一致，红系及巨核系增生受限，网状纤维增生（MFⅡ级）。

图 1. A、骨髓涂片（瑞-吉氏染色 10×10）：有核细胞增生极度活跃   B、骨髓涂片（瑞-吉氏染色 10×100）：视野中可见中性中幼粒、晩幼粒及成熟阶段粒细胞，另可见双核中性晩幼粒及嗜酸性中幼粒细胞。

图 2. A、外周血涂片（瑞-吉氏染色 10×100）：视野中以中性分叶粒细胞为主，可见细胞中颗粒明显增多。另可见 1 个原始细胞及 1 个分叶障碍的粒细胞。B、外周血涂片 (碱性磷酸酶染色 10×10）；低倍镜视野中可见中性粒细胞 NAP 染色呈强阳性 C、外周血涂片（碱性磷酸酶染色 10×100）：油镜视野中性粒细胞胞浆中充满粗大颗粒，呈弥漫深蓝色。

细胞免疫学：骨髓中淋巴细胞约占 2.174%；单核细胞约占 0.482%，表型未见明显异常；有核红细胞约占 5.029%；早期髓细胞约占 1.909%，此类细胞表达 CD34+CD117+CD13+CD33+CD38+CD123+HLA-DR+；粒系比例增高约占 86.805%，该群细胞异常高表达 CD64、CD14、CD56 且 CD33、CD15 表达减弱。

图 3. 细胞免疫学结果

细胞遗传学：采用 R 显带法，显微镜下观察 4 个分裂相，结果显示为：46，XY^[4]，未见克隆性数目及结构异常

图 4. 细胞遗传学结果

分子生物学：
1. 白血病相关融合基因筛查检测结果：WT1/ABL:4.43%，其余融合基因阴性。
2. 髓系预后突变基因检测结果：
二代测序发现存在（68.50%）CSF3R:NM_156039:exon14:c.C1853T:p.T618I 突变，
（56.62%）SETBP1:NM_015559:exon4:c.T2612C:p.I871T rs267607038 突变，
（38.58%）DNMT3A:NM_022552:exon22:c.G2528A:p.G843D 突变，
（30.23%）DNMT3A:NM_022552:exon23:c.C2698 G:p.H900D 突变。

【诊断】结合以上检查结果遂诊断为：慢性中性粒细胞白血病

【治疗】患者转外院血液科进一步治疗

【点评】

CNL 是一种罕见的 BCR-ABL 融合基因阴性的骨髓增殖性疾病，以骨髓中成熟中性粒细胞持续增殖为特征，可累及外周血和肝脾，2001 年 WHO 造血和淋巴组织肿瘤分型中才将其作为独立疾病。患者往往症状不明显，以偶然发现的白细胞升高来诊^[2]。 实验室检查：白细胞明显升高，伴随轻度贫血，伴或不伴有血小板减少，2016 版 WHO 提到常伴有维生素 B12、尿酸升高。WHO2016 版关于慢性中性粒细胞白血病诊断标准：（1）外周血 WBC: ≧25×109/L,≧80% 为中性杆状核和中性分叶核粒细胞，幼稚粒细胞（早幼粒细胞、中幼粒和晚幼粒）<10%，原始粒细胞极少见，单核细胞计数 <1×10⁹ ，无粒细胞发育异常。（2）骨髓高度增生，中性粒细胞比例和数量增高，中性粒细胞成熟表现正常，原始粒细胞占有核细胞比例 <5%（3）不符合 WHO 标准的 BCR-ABL+CML、PV、ET、PMF。（4）无 PDGFRA、PDGFRB，或 FGFR1，或 PCM1-JAK2 重排。（5）有 CSF3R T618I 或近 90% 的患者细胞遗传学正常，其余病例可有克隆性遗传学异常包括+8、+9、+21、del（11q）及（12p）其他激活的 CSF3R 突变；或无 CSF3R 突变，持续中性粒细胞增多（至少 3 个月），脾大或无明确的反应性中性粒细胞增多原因，包括浆细胞肿瘤。如有，则需要细胞遗传学或分子生物学研究证明髓系细胞为克隆性^[1]。这一版关于分子生物学的补充，使依靠排除法诊断 CNL 成为历史。

本例患者病程较长，出现持续性发热，重度贫血面容，右眼结膜下出血苍白，伴脾大。白细胞升高至 116.16×10⁹/L，血红蛋白、血小板降低。尿酸、维生素 B12 增高。骨髓形态学：粒系增生极度活跃，原始细胞占 2%，各阶段粒细胞均增多，且伴有嗜酸性粒细胞比例增高。外周血中性粒细胞比例增高，占 87.5%，幼稚粒细胞（早幼粒、中幼粒、晚幼粒）占 3.5%，少于 10%，原始细胞占 3%，这一点是高于诊断标准。《现代血细胞图谱》提到，中性粒细胞 POX 反应常可减弱，有的甚至呈阴性反应^[3]，很遗憾这一点我们没有及时验证。关于细胞免疫学，2016 版 WHO 对此没有过多描述，本例中，早期髓细胞占 1.909%，此类细胞表达 CD34+CD117+CD13+CD33+CD38+CD123+HLA-DR+。粒系比例增高，此类细胞异常表达 CD56、CD64、CD14 且 CD33、CD15 表达减弱。近 90% 的 CNL 患者细胞遗传学正常，其余病例可伴有克隆性遗传学异常包括+8、+9、+21、del（7q）、del（20q）、del（11q）、del（12p）、-17 及复杂核型异常，克隆性遗传学异常可能出现在疾病进展过程中^[1]。2013 年发现 CSF3R T618I 突变是 CNL 一个高度特异而敏感的分子诊断标志，从而 CNL 的诊断不再是排除行诊断。CSF3R 除最常见的 T618I 突变，其他少见突变尚有 T615A 和 T640N^[4]。此外，CNL 患者还常伴有 SETBP1、ASXL1、TET2、SRSF2、SF3B1、ZRSR2 和 U2AF1 等基因突变^[5]。所以疑似 CNL 的患者应进行前述基因突变筛查，以寻找疾病克隆性证据。本例患者检测到 CSF3R、SETBP1、DNMT3A 突变。CSF3R 是一种穿膜型受体蛋白，具有调节粒细胞的生长、分化和功能的作用。CSF3R 突变常见于慢性中性粒细胞白血病 (CNL)、部分 CEBPA 突变的 AML 患者。CSF3R 突变可发生于近膜区 (T615、T618 突变多见，位于 Exon14) 和胞浆内尾区 (D771fs、Y752X 等截短型突变多见，位于 Exon17)，少数患者同时携带两种类型的突变。近膜区突变 (T618 等) 活化 JAK-STAT 信号通路，对 JAK 激酶抑制剂 Jakafi(ruxolitinib) 等敏感。胞浆内尾区的截短型突变导致 SRC 家族 TNK2 激酶的激活，对 Dasatinib 等敏感^[2]。 SETBP1 是个致癌基因，编码 SET 结合蛋白 1，参与 DNA 复制。该基因突变在 CMML(5-10%) 及 JMML（7%）发生频率较高，MDS 中发生率＜5%；与疾病进展相关^[6]。DNMT3A 基因编码一种 DNA 甲基转移酶。突变见于 18%-22% 的 AML、29%-34% 的 NK-AML；3-18%MDS 病人。与预后不良相关联。该基因突变应用去甲基化药物可能有效。综上本例患者可明确诊断为 CNL，且示预后不良。

CNL 的鉴别诊断难度较大，主要需要同其他可以导致白细胞升高的疾病鉴别，包括其他类型的 MPN 及反应性或继发性白细胞升高。通过检测粒细胞的单克隆性可以排除反应性粒细胞增殖。同其他 MPN 的鉴别诊断除通过细胞形态学检查外，也可通过 CSF3R 突变检测鉴别。CNL 同 aCML 的鉴别诊断更为困难：外周血和骨髓细胞形态学检查中，aCML 的中性粒细胞增多伴前体细胞增加 (早幼粒、中幼粒、晚幼粒占白细胞 >10%)，病态造血显著，并常伴随轻度的嗜碱性粒细胞增高；而 CNL 基本是中性粒细胞增加，几乎无病态造血 (可见中毒颗粒)。尽管 aCML 的 CSF3R 突变相对 CNL 少见，但仅可作为参考。另外，在约 1/3 的 aCML 患者携带 SETBPl 和 ETNKl 突变，也可辅助鉴别诊断^[5、6]。

迄今，CNL 尚无特异有效的治疗手段，羟基脲、α 干扰素、诱导化疗等治疗虽可缓解 CNL 患者的症状，但对其生存期无明显改善，异基因造血干细胞移植被认为是治愈 CNL 的有效方法，新药研制主要集中在 JAK-STAT 和 SRC 激酶抑制剂磷酸鲁索替尼和达沙替尼等，通过干预中性粒细胞增殖，从而改善 CNL 患者的疗效和预后^[7-9]。本例患者因后续在外院治疗，难以追踪其治疗用药及预后状况。

随着分子学诊断的进展，CNL 的诊断标准正在从形态学诊断向结合临床病史、细胞形态、分子基因的综合诊断变迁。CSF3R 突变的发现有助于认识 CNL 发病的分子学机制，并构建更精准的诊疗策略。

（张燕，程辉）

参考文献

[1]Swerdlow SH,Campo E,Harris NL,Jaffe ES,Pileri SA,Stein H,Thiele J(Eds):WHO Classification of Haematopietic and Lymphoid Tissues(Revised 4th edition).IARC:Lyon,2016
[2] 宫子木,Shimin HU. 慢性中性粒细胞白血病诊治进展 [J]. 中国实用内科杂志,2018,38(2):123-126.
[3] 王淑娟，王建中，无振如. 现代血细胞学图谱 [M]. 北京: 人民卫生出版社，2001.
[4]Maxson JE, Gotlib J, Pollyea DA, Fleischman AG, Agarwal A, Eide CA, Bottomly D, Wilmot B, McWeeney SK, Tognon CE, Pond JB, Collins RH, Goueli B, Oh ST, Deininger MW, Chang BH, Loriaux MM, Druker BJ, Tyner JW. Oncogenic CSF3R mutations in chronic neutrophilic leukemia and atypical CML. N Engl J Med. 2013;368(19):1781-1790.
[5] 沈悌，赵永强. 血液病诊断及疗效标准 [M].4 版. 北京: 科学出版社.2018
[6]Gotlib J, Maxson JE, George TI, Tyner JW. The new genetics of chronic neutrophilic leukemia and atypical CML: implications for diagnosis and treatment. Blood. 2013;122(10):1707-1711.
[7]Natasha Szuber, Michelle Elliott, Ayalew Tefferi. Chronic neutrophilic leukemia: 2020 update on diagnosis, molecular genetics, prognosis, and management. Am J Hematol.2020; 95(2):212-224.
[8]Zhang X, Pan J, Guo J. Presence of the JAK2 V617F mutation in a patient with chronic neutrophilic leukemia and effective response to interferon alpha-2b. Acta Haematol.2013; 130(1):44-46.
[9]Menezes J, Cigudosa JC. Chronic neutrophilic leukemia: a clinical perspective. OncoTargets and therapy. 2015;8:2383-2390.

程辉
上海长海医院血液科 副主任技师

长期从事各类血液病的实验室诊断工作，发表论文 60 余篇，其中第一作者发表 SCI 论文 8 篇，第一作者或通讯作者发表中文核心期刊论文 7 篇，参与省部级基金近 10 项，参编专著 1 部。