分子克隆 最强攻略
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以下可能是史上最全、最基础的
分子克隆知识
分子克隆是一个实验室最基础、也是最重要的实验技术，照例先介绍原理！
▋ 基本原理
分子克隆是在分子水平上提供一种纯化和扩增特定 DNA 片段的方法。也就是用体外重组的方法将目的基因插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化或转导的方式，引入适合的受体细胞内，使目的基因得到复制与扩增，然后再从筛选后的受体细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入 DNA 的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增，并使宿主细胞获得新的遗传特征。
还是一脸懵逼？我们可以先了解传统的分子克隆技术，下面的流程示意图可以帮助你在脑海中形成一个初步的印象。
▋ 传统分子克隆基本流程
孔子曰：「敏而好学，不耻下问」。
老实说，上面的好多内容我都不懂……
没关系，那我们就从最基础的各种名词开始，为大家一一详解！
▋ 知识小点
PCR
分子克隆的第一步一般为 PCR，以获得大量的可供连入载体的目的基因。PCR 反应的基本成分包括：模板 DNA、引物、4 种脱氧核苷酸、DNA 聚合酶和适宜的缓冲液。PCR 由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成，具体步骤就在此省略。得到的 PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测，有杂带的需要切胶回收目的片段。
详情可查看：实验技术入门高能小课堂-凝胶电泳篇
您可能会用到：
● 高保真的 Pfu DNA Polymerase
● 快速从凝胶中回收 PCR 产物 Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System
插入 DNA 片段
就是你想要克隆的 DNA 片段，也被称为插入片段（Insert）。它可以来自原核细胞或真核细胞，可以是基因组 DNA、另一质粒的一部分或线性 DNA 片段、实验室中人工合成的 DNA 片段，或者是从 mRNA 反转录产生的 cDNA。
无论来源类型如何，制备插入 DNA 片段时常用的第一个步骤是进行限制性内切酶酶切，产生匹配的粘性末端，以便接下来将片段插入载体中。
载体
载体（Vector）是能携带外源基因（或 DNA 片段）进入细胞复制、整合或表达的工具。载体一般是质粒，也可以是噬菌体。
可以作为克隆载体的条件：
● 具有对受体细胞的可转移性，能携带外源基因进入宿主细胞；
● 能在宿主细胞中自主复制，并实现外源基因的增殖；
● 具有由单一限制酶识别的位点组成的多克隆位点 (MCS)；
● 具有用于选择克隆子的标记基因，例如抗生素耐受。如果宿主整合了质粒，它将可以在含有抗生素的培养基中存活，这样允许我们选择已经成功转化了的细胞。
● 克隆载体必须是安全的，不能含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入受体细胞外的其他生物的细胞，尤其是人的细胞。
您可能会用到：
● 快速纯化质粒系统 PureYield™ Plasmid Miniprep System
在此小编额外为大家介绍几个小小小小的基础知识点：
限制性酶切位点
Restriction Enzyme cutting site
DNA 上一段碱基的特定序列，DNA 限制性内切酶能够识别出这个序列并在此将 DNA 序列切成两段。限制性内切酶位点外一般需要有保护碱基。
多克隆位点
Multiple Cloning Site, MCS
是包含多个（最多 20 个）限制性酶切位点的一段很短的 DNA 序列。每个限制性酶切位点通常是唯一的，即它们在一个特定的载体质粒中只出现一次。
在一些载体中，MCS 位于标记基因内，可筛选已经成功拼接进插入 DNA 片段的克隆子。例如后面会讲到的蓝白筛选。
宿主细胞
宿主细胞也叫受体细胞，指在转化或转导中接受外源基因的细胞。进行基因工程的宿主细胞一般为限制酶缺陷型，便于后续的克隆筛选。宿主细胞有原核受体细胞、真核受体细胞 (最主要是酵母菌)、动物细胞和昆虫细胞（其实也是真核细胞）。原核受体细胞中, 最常用的宿主细胞是大肠杆菌，它生长迅速，可广泛获得不同克隆载体。
一般可根据插入 DNA 片段的类型选择最佳载体及宿主细胞。
以下视频详细介绍了质粒载体的制备，
还有中英文双语对照哦 ～
How to perform plasmid prep
双酶切
分子克隆中通常将插入 DNA 片段和载体进行双酶切，即选择一种内切酶同时切割插入 DNA 片段和载体 DNA，以生成连接所需的互补末端 ，由于载体和插入 DNA 片段末端之间的兼容匹配性，二者仅可沿一个方向连接，因而这种方法可实现目的 DNA 片段的插入。进行双酶切时，同时提供两种酶所需最优的反应缓冲液和反应条件至关重要。因此，为确保酶切成功，应严格遵守供应商提供的双酶切反应建议。
您可能会用到：
● Promega 限制性内切酶
连接
连接 (Ligation) 是插入 DNA 片段和载体连接成为重组质粒的过程，需要 DNA 连接酶，最常用的就是 T4 DNA 连接酶，可连接 DNA 末端的 5′磷酸基和 3′羟基。连接反应通常还需要 ATP、DTT 和镁离子等成分，为了提高连接效率可优化反应条件。
您可能会用到：
● T4 DNA Ligase
点击链接观看视频，视频对连接的步骤进行了非常详细的介绍：
How to ligate a insert into a vector
感受态细胞
感受态细胞（Competent cell）：通过理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来 DNA 的生理状态。主要原理就是使细胞的通透性变大，便于外源基因或载体进入感受态细胞。一般可使用 CaCl2 法或电转法处理受体细胞制备感受态细胞，或直接进行购买。
您可能会用到：
● JM109 Competent Cells
● HB101 Competent Cells
转化
转化（Transformation）是受体细胞直接摄取供体细胞的 DNA 片段而获得新的遗传性状的过程。一般情况下质粒载体的转化效率很低，因此需要先制备感受态细胞。可根据下游应用的不同选择不同的感受态细胞。一般的转化步骤为将连接体系加到感受态细胞中冰上孵育，然后 42°C 下热激活，再至于冰上。处理后，部分质粒 DNA 会被受体细胞吸收，并在体内开始复制。亦可采用电转化的方法，使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体 DNA 分子导入受体细胞。
具体的转化相关介绍请点击以下视频：
How to perform transformation
转化后即可在平板上接种细胞进行培养，点击下方链接观看视频查看详细步骤：
How to plate cells for culture
克隆筛选
接下来我们以最常用的蓝白筛选为例介绍克隆筛选，由于蓝白筛选使用 T 载体进行，因此不需要做双酶切。平板上最终产生的蓝、白菌落中，白色菌落为我们要的目的菌落。蓝白斑筛选是一种分子克隆中常用的克隆筛选方法。
蓝白筛选原理
野生型大肠杆菌可以产生 β-半乳糖苷酶，可以将无色的化合物 X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）切割成半乳糖和蓝色物质，使菌落呈现蓝色。也就是说在 X-gal 底物的平板中可以生长且菌落呈蓝色的是能产生 β-半乳糖苷酶的菌落。
适用于蓝白筛选的基因工程菌为 β-半乳糖苷酶缺陷型菌株。这种宿主细菌的染色体基因组中编码 β-半乳糖苷酶的基因发生突变，导致其编码的 β-半乳糖苷酶失去一个 α 肽段，从而不具有生物活性，及无法产生完整的 β-半乳糖苷酶。未转入质粒载体的受体细胞单独培养只能产生白色菌落。
您可能会用到：
● pGEM®-T Easy Vector Systems
一般的蓝白筛选都会和抗性筛选结合使用，抗性筛选可确定受体细胞是否吸收质粒载体。如选择带有抗生素基因标记的载体，不含载体的细菌不带有抗性基因，无法在含有抗生素的平板上生长；经过转化含有载体的细菌（不管是否含有插入 DNA 片段）都可表达抗生素耐受基因，因而可以在含有抗生素的平板上生长。
您可能会用到：
● Antibiotic G-418 Sulfate
用于蓝白筛选的载体上具有 β-半乳糖苷酶启动子和编码 α 肽段的基因，编码 α 肽段的基因区段中包含一个多克隆位点（MCS），但其本身不影响载体编码的 α 肽链的活性。当该载体被转入宿主细胞中后，载体产生的 α 肽链与宿主细胞产生的 β-半乳糖苷酶突变体互补，具有完整酶的活性，即可将 X-gal 底物分解产生蓝色物质，这种现象叫 α 互补。也就是说转入细胞的载体的多克隆位点上没有插入 DNA 片段时，该菌落呈现蓝色。
实验中通常添加 IPTG 激活载体中的启动子，携带空载体的细胞呈蓝色，插入 DNA 片段与外源基因连接后，重组质粒载体不表达 α 肽链，因此不能分解底物产生蓝色物质，培养表型呈现白色菌落。但是未转入质粒载体的细菌，由于不能形成完整的 β-半乳糖苷酶，菌落也呈现白色。
蓝白筛选步骤
具体了解蓝白筛选步骤可点击下方视频哦
Blue-White cloning
图片、视频来源：普洛麦格