前言
单细胞测序真的非常火！前段时间给大家介绍了一篇 10× Genomics 在干细胞研究中的应用案例，（点击查看：文献解读 | 通过单细胞转录组测序探究 ADRB3 诱导的脂肪重塑轨迹），今天继续给大家解读一篇单细胞转录组测序在肿瘤中的应用案例，该文章同时使用了 SMART - seq 和 10× genomics 两种单细胞测序手段。
基本信息
材料：肝癌细胞系 HuH1 和 HuH7、肝癌组织
方法：FACS、SMART - seq、10× genomics 单细胞转录组测序
期刊：Hepatology
影响因子：14.079
研究背景
肝细胞癌的异质性给临床治疗带来了巨大的挑战。有报道指出肝细胞癌的特性主要归因于肝癌干细胞，肝癌干细胞的自我分化、增殖引导了肿瘤的转移和复发、肝癌病情加重。该篇文章的目的在于揭示肝癌干细胞（CSC）异质性。
研究目的
揭示肝癌干细胞的异质性。
技术路线
技术框线示意图
研究内容
1. 肝癌干细胞表面标志物的异质性
作者首先探究两株肝癌细胞系 HuH1 和 HuH7 中是否存在肝癌干细胞的异质性。选取 CD24、CD133、EpCAM 作为鉴别肝癌干细胞亚群的 marker。通过免疫荧光发现，不同细胞系甚至是同一个细胞系中均存在肝癌干细胞的异质性（图 1）。对分选出的各亚群进行细胞分裂能力和更新能力检测发现，相比于相对于 marker-negative 组，positive 组细胞更新能力显著增强，缺氧造成了部分亚群分裂能力得到增强（图 2）.
图 1 | 免疫荧光技术鉴定肝癌干细胞表面 marker 的异质性
图 2 | 细胞分裂能力和细胞更新能力检测
2. 基于 SMART - seq 技术探究肝癌干细胞的异质性
通过 FACS 分选两株肝癌细胞和一份手术切除肿瘤中的肝癌干细胞，对分选得到的肝癌干细胞进行 SMART - seq 单细胞转录组测序。聚类结果发现，即使是同一来源的肝癌干细胞也存在表达异质性（图 3）。为了鉴别单细胞测序得到的基因表达特征是否具有临床指导意义，作者筛选 Triple+ 单细胞和 Triple- 单细胞中的差异基因并进行生存曲线分析，结果发现 Triple+ 单细胞中 marker 基因的表达可以预测患者的预后情况（图 3）。
对各亚群 marker 基因进行 Venn 和 IPA 分析发现，各亚群 marker 基因之间的组成和功能差异较大，各亚群 marker 基因均与肝细胞癌的预后密切相关（图 4）。
图 3 | 基于 SMART - seq 的聚类分析和预后诊断
图 4 | Venn 分析和 IPA 分析结果
3. 10× Genomics 单细胞转录组测序探究肿瘤异质性
为了进一步探究肿瘤的异质性，作者对 HuH1、HuH7 和 P1 进行 10× Genomics 单细胞转录组测序。结果发现，肝癌干细胞 marker 基因和肝细胞癌 marker 基因等在各样本中表达差异较大（图 5）。相比于两个细胞株，临床样本 P1 虽然表达肝癌 marker 基因，却很少表达肝癌干细胞 marker 基因，此外，P1 中 T 细胞和 B 细胞表达量较高，相关基因的表达信息可能反映了病人的病情状况。
图 5 | 基于 10× Genomics 的聚类分析和 marker 基因表达结果
参考文献
Zheng H, Pomyen Y, Hernandez M O, et al. Single‐cell analysis reveals cancer stem cell heterogeneity in hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology, 2018. doi: 10.1002/hep.29778