前言
Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity
为了适应环境和抵御外界的威胁，从原核生物到人类都有其强大的免疫系统，且这些免疫系统都分化出了高度特异性（即疾病特异性）的免疫细胞类型，这些细胞一起预防和消除疾病。目前最热门的单细胞技术，对于理解免疫系统如何产生针对许多不同病原体的潜在反应是至关重要的。
本篇综述概述了现有的单细胞技术，并讨论了它们的优点和局限性。我们还探索这些方法如何加深我们对免疫应答和疾病的理解，并且我们调查了该领域的前沿趋势和潜在创新点。
单细胞技术简介
目前有许多单细胞测序技术，但他们对于细胞分析的广度（即每个实验回收的细胞数）和深度（即每个细胞的基因表达）有显著差异。可以将单细胞技术分为两大类：「targeted」技术（FACS，CyTOF，qPCR）和 unbiased 技术（plate-based protocol，Fludigm C1，pooled approaches，massively parallel approaches）。
Table 1. Summary of current single-cell profiling technologies
FACS：荧光激活的细胞分选技术
Droplet microfluidics 一次可以捕获上万个细胞，适用于发现稀有细胞类群或研究整个组织/器官的高度异质性群体。但该技术对于单个细胞的敏感度较低，不适用于鉴定细胞之间微小的转录表达差异。plate-based protocols 和 Fluidigm C1 适用于对单个细胞进行随机变异或细胞间微小的转录差异等进行深度研究。实际应用中可以将几种方法相互结合利用。
Figure 1 | Overview of scRNA-seq technologies. BCR: B cell receptor, TCR: T cell receptor
单细胞测序技术的应用
（1）表征不同的细胞亚群
Jaitin et al. 利用 MARS-seq 技术鉴定了正常小鼠脾脏细胞的多样性，将其分为不同的细胞类群：B 细胞、巨噬细胞、单核细胞、自然杀伤细胞（NK cell）和浆细胞样树突细胞。此外，用脂多糖（LPS）刺激模拟病毒性感染，结果发现，诱导了所有类型细胞的 I 型干扰素（type I IFN）响应基因表达，表明脾脏细胞群体通过上调 I 型干扰素应答的抗病毒基因对病毒感染做出反应。（Fig.2a）
Figure 2 | scRNA-seq uncovers distinct cell subsets in the healthy immune system. NK: natural killer cell, pDC: plasmacytoid dendritic cell
Bjorklund et al. 对已知具有异质性的人扁桃体和小肠的 CD127+先天性淋巴细胞 (ILCs) 进行单细胞测序，发现了 4 个明显不同的亚群：ILC1, ILC2, ILC3 和 NK 细胞，与之前的研究结果一致（based on surface marker expression）。此外，还发现了两个新的小肠 ILCs 亚群（Fig.2b）
Figure 3 | Single-cell profiling uncovers distinct cell subsets in disease
Gaublomme et al. 构建体外和体内 EAE 模型，用单细胞测序鉴定 T helper 17 (TH17) 的细胞状态，发现 TH17 细胞有高度异质性。对体内和体外分离的致病性 TH17 细胞进行比较分析，揭示了其相似但不完全一致的宽泛的致病能力的图谱，发现了可能导致 TH17 细胞致病性的基因：Gpr65, Plzp, Toso 和 Cd5l，这些 marker gene 可以用于预防和治疗多发性硬化。
（2）表征同一个群体的异质性
Figure 4 | Characterizing heterogeneity within one immune cell population using scRNA-seq
Shalek et al 研究了 LPS 刺激的骨髓衍生的树突状细胞（BMDCs），发现 LPS 响应通路基因的 mRNA 丰度在不同细胞间有显著差异，表明所观察到的异质性对每个细胞都有功能性的结果。这种转录异质性可能使 BMDC 具有广度或灵活性来适当地响应多种类型和水平的感染。这也是首次报道单细胞之间 mRNA 剪切模式的异质性。此外，BMDC 具有抗病毒主调控基因 Irf7 和 Stat2 的双峰表达，这反过来又促进许多其他抗病毒基因的双峰表达。
（3）决定细胞命运的分支点
Figure 5 | scRNA-seq helps identify cell fate branch points during HSC differentiation.HSC: 造血干细胞
单细胞技术应用的新方向
（1）综合分析免疫普和分子状态
可以加深对淋巴等免疫细胞行为的理解，特别是当这些方法可以缩放到更大的数据集时。
（2）开发可以代替细胞培养或小鼠模型的工具
这样不仅可以分析正常的人体免疫系统，还可以分析目前很少研究的自身免疫和炎症性疾病的免疫应答，如类风湿性关节炎、克罗恩氏病和牛皮癣。
（3）将细胞的不同表型参数与其转录组整合在一起。
如，骨髓的细胞定位对于其下游的命运有重要影响，但在单细胞测序分析的过程中其细胞定位和微环境均丢失了，希望通过研究新的试验和分析方法以重构细胞的空间结构。
（4）除单细胞转录组外，希望在基因组、染色质、甲基化和蛋白质组学分析上有新进展