商业项目

mRNA转录组测序

2025-12-09 11:05 来源：丁香园 作者：上海旭燃生物科技有限公司
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一、项目周期
项目流程：抽提质控+建库+测序+分析
正常项目周期：10-15 个自然日
加急项目周期：7-10 个自然日

二、服务介绍

转录组是某个个体的特定组织的某一功能状态下产生的所有RNA的总和，是研究表型和功能的重要手段。mRNA是在蛋白质合成时充当模板的RNA。mRNA-seq是为检测mRNA表达、加工发展出来的高通量测序技术。其技术原理，是对RNA中含有polyA尾的mRNA和部分lncRNA，使用oligo dT进行富集。进而对富集下来的mRNA/lncRNA进行片段化，经过逆转录、公共测序接头连接、PCR扩增之后，得到测序文库。进而对测序结果进行生物信息学分析，从而获得RNA中的基因表达、可变剪接、RNA编辑等信息。


三、操作流程

1、总RNA的提取

2、mRNA的富集和文库构建

3、Hiseq6000测序

4、数据处理与生物信息分析

5、生成测序报告

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四、数据分析

1、标准信息分析


  1)对原始数据进行去接头、去污染序列及低质量reads处理


  2）和参考基因组进行比对，进行测序评估


  3）新转录本预测及注释；已知基因结构模型优化


  4）基因差异表达分析


  5）可变剪切事件分析


  6）差异基因的功能注释


2、定制个性化信息分析


  结合客户的需求，进行个性化的信息分析


五、送样指南                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                
样本类型处理方法保存、运输介质注意事项:
动物组织（各类哺乳动物、寄生虫等）组织离体后，需用0.9%生理盐水漂洗，以去除血渍和污物，分切组织约50mg(绿豆粒~黄豆粒大小）迅速将其放入冻存管或锡箔纸包裹，液氮冻存，放于-80冰箱，操作时间应小于3min，组织离体时间越久，RNA降解程度越高-80℃冰箱（保存）
液氮（保存或运输）
干冰（运输）
RNAlater动物组织RNA稳定保存液（-80℃长期保存，干冰运输或4℃短途运输）
 		-20℃下短期保持（如：小鼠肌肉组织3个月左右开始出现降解），-70℃下长期保存；
新鲜组织样本不建议加入福尔马林固定，固定时间过长会导致RNA降解；
福尔马林固定的组织控制在8 ~ 24 h 内为宜，样本存放时间不宜超过1 年;
不建议加Trizol保存的大块组织，可研磨后的组织保存在Trizol中。
细胞去除培养液，每10cm2细胞加入2ml Trizol（贴壁细胞切记胰酶消化），或者按每5×106个细胞加1 mL Trizol（悬浮细胞），涡旋或用枪吹打消化，再转移至冻存管中Trizol（置于-80℃保存）
干冰（运输）
液氮（运输）		活性细胞抽提RNA需要加trizol保存；
不建议用PBS，培养基悬浮细胞的样本。
微量细胞可提供1个-2*105个细胞进行Single Cell mRNA项目。Trizol（置于-80℃保存）
干冰（运输）
液氮（运输）		加入500-1000ul Trizol保存
FFPE样本从取下组织到完成包埋所用时间尽可能短，取样时避免混入脂肪组织，经福尔马林固定的组织控制在8 ~ 24 h 内进行包埋。4°运输（长期保存）不建议送干裂贴片组织；
不建议经过HE染色后的组织切片或切割组织。
血液>1ml新鲜血液中加入抗凝剂（不推荐肝素，EDTA最佳），将试管迅速放入-80℃冰箱-80℃冰箱（保存）
干冰（运输）
液氮（运输）
 		可使用抗凝管进行采集和保存；
200ul以上避免反复冻融，-20℃下可最多保存2年，-80℃下长期保存：全血、白细胞、血凝块、 血清或血浆；
或者分离出PBMC加 trizol 混匀，干冰运输
总RNARNA主带清晰，无色素、蛋白、糖类等杂质污染，28S/23S亮度大于18S/16S；通常样本浓度50ng/ul以上，体积大于10ul，提供建库总量外，需提供质检用量：扣除1ul 测浓度和约300ng电泳用量-80℃冰箱（保存）
干冰（运输）
液氮（运输）
 		建库用量如下
1)mRNA-seq,  lncRNA-seq：总RNA 300ng以上
2)small RNA-seq：总RNA 300ng/分离好的small RNA 100ng/外泌体和血清small RNA 10ng以上
3)circular RNA-seq：总RNA 10ug以上
4)RIP/Clip-seq若需去除rRNA富集需总RNA 1000ng以上；
若直接建库，总RNA 50ng以上
植物样本植物样本相对动物样本稳定，可直接用锡箔纸包裹编号，放入-80℃冰箱保存-80℃冰箱（保存）
干冰（运输）
液氮（运输）
 		需提供新鲜组织；
对于含有多糖多酚等次生代谢产物的衰老叶片可在4℃黑暗环境下饥饿1-2天

 

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编辑： 李晶辉

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