以带负电荷的微孔淀粉颗粒 (M) 和多层季铵化淀粉 (Q+)/T−层为基础，通过层层组装灵活构建了由淀粉和植物多酚组成的生物质衍生多层结构止血微粒 (MQxTy)(图 1a)。随着 Q+/T−层数的增加，MQxTy 微粒子的孔数明显减少。与 M 相比，MQxTy 微粒子的平均粒径随着 Q+/T−层数的增加而增大 (图 1c)。同时，由于最外层带电层的变化，MQxTy 微粒的 zeta 电位交替为正或负 (图 1d)。结果表明，通过层层组装法制备了 MQxTy 微粒子。对 MQxTy 微颗粒在水中进行了流变学分析，比较了它们在液体中的分散状态和粘度。MQ 和 MQT 表现出相似的存储模量 (G′) 和损耗模量 (G′′)，这一结果表明其为类固体的结构。相反，MQ2T、MQ2T2 和 MQ3T2 颗粒的 G′值明显大于相应的 G′′值。如图 1e 所示，MQ2T、MQ2T2 和 MQ3T2 微颗粒的复合粘度明显高于 MQ 和 MQT 微颗粒，并随着角频率的增加而降低。高复合粘度和剪切变薄现象进一步证实了 MQ2T、MQ2T2 和 MQ3T2 微颗粒具有弹性、高粘度和良好的类固体力学响应。
通过细胞相容性和血液相容性试验证实 MQxTy 微颗粒的体外生物相容性。如图 2a 所示，使用成纤维细胞 (L929) 评估 MQ2T、MQ2T2 和 MQ3T2 微粒的细胞活力。MQ2T、MQ2T2 和 MQ3T2 微颗粒在 16 mg/mL−1 的高浓度下表现出较高的细胞存活率 (>90%)，说明材料有良好的细胞相容性。所有 MQ2T、MQ2T2 和 MQ3T2 微粒在不同浓度下的溶血率都很低，最高可达 2%(图 2b)，证实了它们具有良好的血液相容性。采用血凝指数 (BCI) 法评价 MQ2T、MQ2T2 和 MQ3T2 微颗粒的体外止血性能。以医用纱布和市售淀粉基可吸收止血剂 (Arista) 为对照组，进行体外止血试验。图 2c 所示，医用纱布和 Arista 的 BCI 值高 (不含 CaCl2)， BCI 值低 (含 CaCl2)，说明医用纱布和 Arista 在常规出血时具有中等止血性能，而在大出血时具有较低止血性能，这与医用纱布和 Arista 在小出血中的临床应用是一致的。有趣的是，MQ2T2 组的 BCI 值与 CaCl2 无关，表明 MQ2T2 微粒的止血性能与凝血系统无关。更重要的是，MQ2T2 组的 BCI 值明显低于 Arista 组和 MQ2T/MQ3T2 组，说明 MQ2T2 在 3 种 MQxTy 微颗粒中止血性能最好。为了探讨不同 MQxTy 微粒的止血机制，进行了血小板粘附/活化和红细胞粘附/聚集试验。如图 2f 所示，与 MQ2T/MQ3T2 相比，MQ2T2 的非粘附红细胞数量 (以 HGB 含量限定) 明显减少，表明其 RBC 聚集性最高。此外，直接观察到大量红细胞粘附在 MQ2T2 颗粒上 (图 2f;)，而 MQ2T/MQ3T2 组中只有少数红细胞。这些结果都证实了 T-层最外侧的 MQ2T2 在血小板粘附/活化和 RBC 聚集方面比 MQ2T/MQ3T2 具有很大的优势。建立 SD 大鼠体内具有圆柱形骨孔 (Φ2*3 mm) 的松质骨缺损，研究 MQ2T2 对难治性出血的止血作用。将大鼠随机分为空白组 (未处理)、骨蜡组 (孔内填充骨蜡) 和 MQ2T2 组 (孔内填充 MQ2T2)。空白组术后 1-4 天观察到骨孔充血 (蓝色圆圈表示)(图 2 g)，说明松质骨缺损后持续出血。相反，骨蜡组和 MQ2T2 组在 7 天的愈合期内均未观察到明显的血液充血。术后采集大鼠全血进行分析，HGB 水平低通常与术后出血或贫血有关。在第 7 天，MQ2T2 组的 HGB 水平明显高于空白组和骨蜡组 (图 2 h)。这一结果表明 MQ2T2 恢复/产生 HGB 的能力更好，可能是由于在愈合过程中减少了失血。此外，通过 H&E 染色评估骨样本的出血到愈合过程 (图 2i)。在第 1 天和第 2 天，三组均观察到大面积出血部位 (白色圆圈) 和少量完整血管 (红色箭头)，说明顽固性出血仍在继续。定量分析显示，与骨蜡组相比，MQ2T2 组从第 4 天开始出血部位面积更小，缺损区域修复和完整血管更多。
考虑到长期骨修复前的持续出血行为，一种理想的骨缺损止血材料也应该对骨修复有积极的作用。通过显微 ct 观察三组大鼠术后骨膜骨痂形成情况。在第 1 天，三组均观察到明显的骨孔，证实骨缺损模型生成良好 (图 3a,b)。第 4 天，仅 MQ2T2 组在孔上观察到少量骨膜骨痂 (新骨)。如图 3c、d 所示，通过骨密度和 3d 重构来区分骨样本的新骨和原骨。在第 7 天，MQ2T2 组骨膜骨痂体积明显高于骨蜡/空白组。显微 ct 结果表明，MQ2T2 比市售骨蜡具有更好的骨修复效果。
选取全血样本中淋巴细胞 (LY) 和嗜酸性粒细胞 (Eos) 的含量作为评价术后炎症相关细胞水平的生理指标。如图 4a 所示，在第 4 天，MQ2T2 组的 LY 含量仅显著低于骨蜡组。并且，在第 2 天，MQ2T2 组的 Eos 含量明显低于骨蜡组 (图 4b)。MQ2T2 组和骨蜡组的 Eos 含量在第 4 天和第 7 天无显著差异 (这与组织学分析结果不同。这种差异可能归因于 MQ2T2 在骨孔处的局部处理。选择肿瘤坏死因子和白细胞介素-6 来评估炎症或免疫调节相关蛋白/细胞因子的水平。通过骨切片的免疫组织化学分析评估肿瘤坏死因子和白细胞介素-6 的表达结果 (图 4c-e)。在第 1-7 天骨蜡组清晰可见两种因子的表达，而空白组和 MQ2T2 组无明显表达。以上结果证实 MQ2T2 组在愈合过程中炎症/免疫反应明显低于骨蜡组。使用刚果红染色直接可视化 MQ2T2 微颗粒在骨骼和周围肌肉中的降解过程。MQ2T2 微颗粒由于其多糖 (Q+和 M) 成分，在骨和肌肉切片中被染色为红色 (图 4f)。第 1 天明显观察到大量红点，第 2-7 天逐渐减少。特别是在第 7 天，所有红色淀粉从组织中消失。这些结果清楚地表明 MQ2T2 可以在骨骼和肌肉组织中有效地降解。小鼠松质骨缺损模型显示，MQ2T2 治疗不仅止血效果优于骨蜡，而且显著促进骨修复。
为了研究 MQ2T2 对大型哺乳动物的潜在影响，创建了一个比格犬松质骨缺损模型作为概念验证研究 (图 5a)。图 5b 为第 0 周至第 2 周三组骨孔的代表性照片。MQ2T2 组骨孔在愈合过程中被越来越多的结缔组织覆盖。相反，空白组和骨蜡组在第 2 周仍出现裸骨孔。这些结果表明，MQ2T2 处理有助于结缔组织的快速修复。为了评估骨修复过程，在第 4 周切除比格犬的缺损胫骨，并通过显微 ct 评估 (图 5c)。空白组 (Beagle 1) 在横截面 1 和横截面 3 有两个明显的孔，只有横截面 2 有一些骨膜老茧。骨孔的 3d 重构图像和骨膜老茧的定量数据也证实 MQ2T2 组产生的骨膜老茧数量高于骨蜡组和空白组 (图 5d,e)。在第 4 周切除缺损胫骨周围的肌肉，进行 H&E 染色分析 (图 5f)。骨蜡组在第 1 周至第 4 周产生大量炎症相关细胞 (红色箭头所示)，说明骨蜡的生物相容性较差。相反，由于 MQ2T2 具有良好的生物相容性，MQ2T2 组在第 1 周时炎症相关细胞较少，从第 2 周开始组织形态正常 (正常细胞有序，无炎症相关细胞)。这项概念验证研究的所有结果都证实了 MQ2T2 微颗粒在大型哺乳动物松质骨缺损模型中具有良好的特性 (止血、骨修复和生物安全性)，具有很大的临床应用潜力。
综上所述，多层结构的 MQxTy 微颗粒具有高效的可降解性、低细胞毒性和良好的血液相容性。具有两个 Q+层和最外侧 T-层的 MQ2T2 具有独特的血小板粘附/活化和红细胞聚集特性，具有最佳的体外止血性能。在小鼠松质骨缺损模型中，MQ2T2 显示出良好的止血效果、低炎症/免疫反应、高生物降解性和促骨修复性能。比格犬的验证试验进一步证实了 MQ2T2 在大型哺乳动物骨缺损出血治疗中的良好效果。研究结果表明，这种基于生物质的多层结构微球是非常有临床应用前景的止血材料。
原文链接：ttps://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202002243