《《实验室》》
师弟：师姐救命！我这两天做免疫荧光简直要崩溃了！昨天养的 HUVEC 细胞，染色时一冲洗就全掉光了...今天更离谱，明明用移液枪轻轻加的试剂，隔壁孔的 FITC 信号居然串到这边来了！现在数据根本不能用...
师姐：你这情况我太熟了，去年做血管生成实验时，染色一直做不好浪费了三个月。你细胞脱落是因为普通载玻片表面处理不到位， 荧光串扰也是因为传统 8 孔板孔间距过低，尤其是样本量再一大，觉也不用睡了。
师弟：我记得你当时还需要长时间实时观察活细胞动态，那你最后怎么解决的？求求求！
师姐：很简单，我用的ibidi 8 孔高壁腔室载玻片
……
如果您在细胞培养过程中，也遇到诸如贴壁脱落、细胞状态差、染色不均匀等问题，赶紧来试试 ibidi µ-Slide 8 孔高壁腔室载玻片～我们贴心的为大家准备了一份「案例指南」——利用 ibidi µ-Slide 8 孔高壁腔室载玻片培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）并对其进行免疫荧光染色，本方案同样适用于其他贴壁细胞。
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福利先送到~~
ibidi 8 孔高壁腔室载玻片 免费试用啦！细胞培养、固定、染色及成像的一体化设计，采用高光学质量的 1.5 号聚合物盖玻片底部，适用于大多数显微技术。只需少量细胞和试剂，就能进行高效实验，高壁设计还能有效防止各孔间的交叉污染！无论是活细胞还是固定细胞的荧光显微镜观察，还是长时间的活细胞成像、转染实验等，这款载玻片都能轻松应对。
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利用 ibidi µ-Slide 8 孔高壁腔室载玻片培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）并对其进行免疫荧光染色
注意，在进行荧光肌动蛋白染色实验前，为确保实验的准确性和可靠性，需要注意以下关键因素的影响：
1.包括但不限于细胞密度、细胞培养容器几何形状以及基质/涂层等。
2.为验证染色效果，设置阳性与阴性对照亦不可或缺。
基于以上考虑，我们强烈建议在实验开展之前进行充分的文献调研，以控制实验条件获取完美可靠的实验结果。
实验材料
1.细胞培养
人脐静脉内皮细胞（HUVEC，C-12203，Promocell）
胶原蛋白 IV（354233，Corning）
0.05 M HCl（X942.1，Carl Roth）
细胞培养基：内皮细胞基础培养基（C-22210，Promocell）与内皮细胞生长培养基补充剂（C-39215，Promocell）
磷酸盐缓冲液（14190144，Gibco）
Accutase 细胞解离液（A1110501，Gibco）
2.免疫荧光染色
磷酸盐缓冲液（14190144，Gibco）
即用型 10% 福尔马林（HT5011，Sigma Aldrich）
单克隆抗 α-微管蛋白抗体（T5168，Sigma Aldrich）
抗小鼠 IgG-Atto 594 抗体（76085，Sigma Aldrich）
鬼笔肽 488 缀合物（ab176753，Abcam）
ibidi 含 DAPI 封片剂（50011，ibidi）
Triton-X-100 破膜剂（A16046，赛默飞世尔科技公司）
透化缓冲液（0.5% Triton-X-100，PBS）
封闭缓冲液（1% BSA + 0.2% Triton X 100，PBS）
抗体稀释缓冲液（1% BSA + 0.05% Triton X 100，PBS）
牛血清白蛋白（BSA）（A1470-10G, Sigma Aldrich）
ibidi 镜油（50101，ibidi）
实验仪器
µ-Slide 8 孔高壁腔室载玻片，经 ibiTreat 处理（80806，ibidi）
µ-Slide 载玻片滑架（80003，ibidi）
标准细胞培养设备（移液管、无菌工作台、细胞培养箱、培养瓶、细胞培养基、血细胞计数板等）
配备适当滤片组的-倒置荧光显微镜
实验步骤
1.细胞培养
在使用 µ-Slide 8 孔高壁腔室载玻片（经 ibiTreat 处理）前，请仔细阅读并遵循使用说明。确保所有操作均在无菌条件下进行。在实验开始前，于标准细胞培养瓶（如 T75 细胞培养瓶，底部以用 0.05 M HCl 稀释得到的 6.7 μg/mL 胶原蛋白 IV 包被 1 h）中培养 HUVEC 细胞，并确保细胞能成功贴壁于培养瓶底部。实验当天，细胞应健康良好，并达到最佳亚融合状态。在整个实验过程中，务必迅速操作以避免腔室干燥。
除非另有说明，所有给定的体积均指每个腔室所需之体积，且所有培养步骤均应在室温条件下进行。
用 Accutase 细胞解离液解离 HUVECs 1～2 min；
收集细胞悬液，离心，弃上清，随后用适量培养基重悬并进行细胞计数——稀释量需根据目标细胞浓度进行调整；
计数细胞，用内皮细胞培养基调节细胞密度至 2 × 105 cells/mL；
拆开 µ-Slide 8 孔高壁腔室载玻片（经 ibiTreat 处理）的包装，并将其置于 µ Slide 载玻片滑架或适当的平面上；
在每个腔室中加入 250 µL HUVEC 细胞悬液；
用附带的盖子盖住腔室；
将载玻片连同载玻片滑架放入培养箱（37 °C，5% CO2 ）中至少 3 h 或过夜，使得细胞贴壁。
2.细胞固定、破膜及封闭
在实验开始前，配制足量的透化缓冲液以及封闭缓冲液；
从各个腔室中吸去细胞培养基；
在各个腔室中缓缓加入 100 μL 磷酸盐缓冲液以洗涤细胞，洗涤完毕后，将磷酸盐缓冲液全部吸去；
在各个腔室中加入 200 µL 10% 福尔马林固定细胞 10 min；
固定完毕后，吸取全部福尔马林，并用 200 µL PBS 先后洗涤细胞 3 次，以洗脱残余福尔马林；
在各个腔室中加入 200 µL 透化缓冲液，孵育细胞 10 min；
吸去全部透化缓冲液，在各个腔室中缓缓加入 200 μL PBS 以洗涤细胞；
在各个腔室中 200 µL 封闭缓冲液处理细胞 30 min。
3.荧光染色
在进行封闭步骤时，准备足够的抗体稀释缓冲液来稀释一抗和二抗；
用抗体稀释缓冲液稀释一抗（即单克隆抗 α-微管蛋白抗体）
——单克隆抗 α-微管蛋白抗体——以 1:200 比例稀释
在各个腔室中加入 150 µL 一抗溶液，孵育细胞 2 h（请注意，许多抗体需要在 4 °C 孵育过夜）；
用 200 µL 封闭缓冲液先后洗涤细胞 2 次；
用相同的抗体稀释缓冲液稀释二抗（即抗小鼠 IgG- Atto 594 抗体）和鬼笔环肽 488 缀合物
——抗小鼠 IgG- Atto 594 抗体——以 1:200 比例稀释；
——鬼笔环肽 488 缀合物——以 1:1,000 比例稀释。
在各个腔室中加入 150 µL 二抗溶液，孵育细胞 2 h——从此时起，细胞应尽可能处于避光环境中；
用 200 µL 封闭缓冲液先后洗涤细胞 2 次；
弃去各个腔室中的全部上清液；
在各个腔室中加入一滴 ibidi 含 DAPI 封片剂；
4 °C 低温储存，直至进行镜检成像。由于长时间储存可能导致图像质量下降，因此建议尽快进行镜检。
4.镜检成像
在荧光显微镜下使用适当的滤片组和 ibidi 镜油（ibidi，50101）镜检；
若有需要，可叠加图像以合成叠加场图像。
实验结果示例
如上图所示，HUVEC（人脐静脉内皮细胞）在 µ-Slide 8 孔高壁腔室载玻片（经 ibiTreat 处理）中进行免疫荧光染色后，使用尼康宽场荧光显微镜上的 60 倍油镜镜检。
红色区域示：F-肌动蛋白细胞骨架（鬼笔环肽 488 缀合物染色）
绿色区域示：微管蛋白（小鼠单克隆抗 α-微管蛋白抗体 + 抗小鼠 IgG-Atto594 染色）
蓝色区域示：细胞核（DAPI 染色）
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ibidi 8 孔高壁腔室载玻片核心优势：
高通量实验好帮手：8 个独立井和不可拆卸聚合物盖玻片底部的盖玻片培养腔室，允许同时操作多个样本，再也不担心交叉污染。
细胞培养更出色：ibitreat 表面，多种细胞类型都能良好贴壁，细胞不再松松垮垮一碰就散。
独立孔壁结果精准：杜绝孔间荧光串扰和污染，实验数据准确可靠，重复性好。
适配多种实验条件：染色固定溶液、CO₂ 培养箱和多种显微镜技术都能用，标准化设计轻松整合数据。
生物相容性材料安全：无需胶水，不怕泄漏，实验过程安心稳定。
同规模实验都能用：有大盒装、90 个单独包装或 120 个（15 托盘 * 8 片）µ - Slide 载玻片可供灵活选择，满足不同需求。