高通量外泌体蛋白组学

外泌体作为机体天然信息传递的载体在细胞间通信中发挥着重要作用，由于蛋白质是外泌体的重要组成成分，分析外泌体的蛋白质组成有助于推动外泌体功能的研究，基于质谱的蛋白质组学的技术为外泌体的蛋白质组成提供了技术保障。通过全面研究外泌体的蛋白质，有助于研究外泌体及蛋白质在生命活动中的作用，以及发现与疾病相关的蛋白质，作为疾病早期诊断和预后评估的生物标志物。

逸微健华为您提供外泌体非标记定量蛋白组学（DIA、Label free）和同位素标记定量蛋白组学（SILAC、iTRAQ、TMT）服务。

技术原理

标记定量蛋白组

iTRAQ/TMT
iTRAQ（isobaric tagging for multiplexed relative and absolute protein quantitation）和TMT(tandem mass tag)是目前应用较为广泛的蛋白质定量方法之一。两个方法的原理类似，都是化学体外标记方法。由于生产商不同（iTRAQ的生产商为为AB Sciex， TMT的生厂商为Thermo Fisher），所以标记规格和标签分子结构有差异。这两种方法可检测出低丰度的蛋白，胞外蛋白，膜蛋白，胞浆蛋白，核蛋白等，可同时处理多个样本，鉴定和定量的结果同时得出且准确，适用比较蛋白组分析，鉴定差异蛋白。

图1. TMT技术流程

SILAC
SILAC (Stable Isotope Labeling By Amino Acids In Cell Culture) 的基本原理是通过培养，利用天然同位素（轻型）或者稳定同位素（中型/重型）取代相应氨基酸。经过5-6次传代后，稳定同位素可以完全掺入到新合成的蛋白质中。不同标记的细胞或者蛋白等比例混合后，引入质谱鉴定。如果峰值呈现为1：1，则表示此蛋白的含量无差异。如果含有重型氨基酸的峰值偏高，说明重型氨基酸标记的组中此蛋白含量更高。SILAC的优点是蛋白标记效率高，传代6-8代后，灵敏性高。可检测水平低的蛋白含量变化和翻译后修饰，且样本需求量小，每个样本仅需几十微克，缺点是耗时长。

图2.SILAC技术流程

标记定量蛋白组

Label free
非标记（Label free）蛋白质定量利用液质联用技术将蛋白质酶解形成多肽后进行质谱分析，通过计算蛋白肽段的鉴定数目和色谱峰面积进行蛋白质相对定量。该方法的优点是无需昂贵的标签做内标，且样本制作过程简单，由于操作步骤少，可尽量减少人为和系统误差。但是数据分析相对标记定量而言难度更大更复杂，且重复性较差，对仪器的稳定性和重复性要求高。通过在样本中添加已知含量的标准蛋白还可以实现绝对定量。

图3.Label free技术流程
DIA
DIA数据非依赖采集（Data independent acquisition，DIA）是近年来备受瞩目的质谱采集技术之一。属于非标记技术的一种，DIA技术的原理是在质谱数据采集时，高速、循环的将每个采集窗口内的所有母离子及其碎裂后的子离子进行全扫描，而非根据母离子信号强度筛选后进行二级碎片再扫描。DIA相比于传统label free的最大的优势在于高效测定复杂样品中相对低丰度的蛋白分子，极大地提高了定量分析的可信度。

图4.DIA技术原理

服务流程

客户提供

血清、血浆、脑脊液、尿液、胸水、腹水、唾液等体液、细胞上清、植物样本和其他特殊样本，也可以提供已经提取好的外泌体。

送样要求

不同生物流体样本类型根据后续研究目的和方法按照要求进行样本前处理。
注：

1. 血浆样本：请用EDTA抗凝管采集血液，将采集到的血液在4 ℃下1500 g，离心20 min，去除血液中的细胞；取上清，4 ℃下3000 g，离心15 min，收集上清（血浆），-80 ℃保存，足量干冰寄送。

2. 血清样本：血液收集在离心管中室温条件下静置1 h进行凝固分层；然后3000 rpm室温离心10 min;取上清转至干净的离心管中。再12000 rpm、4 ℃离心10 min，取上清分装到 1.5 mL 离心管中每管0.2 mL，-80 ℃冻存，足量干冰寄送。

3. 尿液样本：采集前、中、后段晨尿，4 ℃条件下2000 g离心20 min，除去细胞，-80 ℃保存，足量干冰寄送。

4.  细胞上清：先用200-300 g离心10 min，再用3000 g离心10 min，最后0.22 μm过膜或者10000 g离心30min。