强强联合 | Evosep - Exploris 480 蛋白质组学高效分析

2022-05-19 14:38 来源:丁香园 作者:
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在当今蛋白质组学的研究热潮中,液质联用技术的应用已经非常广泛。在精准医学和大队列组学背景下,研究人员往往需要对大量样本实现快速高效检测。为了满足各实验室与日俱增的对复杂样品的检测需求,赛默飞作为蛋白质组学领域的领导者,最近三年接连推出了智能化 Orbitrap Eclipse、Orbitrap Exploris 系列质谱以及 FAIMS Pro、FAIMS Pro Duo 等新技术,大大提高提高了质谱的检测灵敏度及功能多样性。

除质谱外,液相作为 LC-MS/MS 平台的重要组成部分,也需兼具灵敏度、稳健性和易用性。丹麦 Evosep 公司在 2017 年发布的 Evosep One 液相,具有通量高、标准化、样本残留低等优点,不失为大队列及临床应用的不错选择。

01 Evosep One 与 FAIMS-Orbitrap Exploris™ 480 联用

FAIMS Pro 搭载 Orbitrap Exploris 质谱仪,为简化操作而设计,在仪器生产率和耐用性方面树立了新标准。在 Orbitrap Exploris 480 联合 FAIMS Pro 的第一篇性能评测文章中 [1],Jesper V. Olsen 教授就使用了 Evosep One 短梯度高通量蛋白组学分离系统,如图 1,单个 FAIMS CV 电压下,上样 500ng Hela 肽段,配合 21 分钟短梯度(每天可分析 60 个样品),FAIMS-DDA 方法可鉴定 3473 个蛋白,FAIMS-DIA 方法定量超过 5000 个蛋白。(详见微信稿: 新鲜出炉!Orbitrap Exploris™ 480 第一篇文献)

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图 1. Evosep One 液相与 FAIMS-Orbitrap Exploris™ 480 联用评测结果。500ng hela 酶解肽段的蛋白鉴定数。A. 21 min DDA/ FAIMS-DDA 的结果; B. 21 min DIA/ FAIMS-DIA 的结果。(点击查看大图)

02 Evosep-FAIMS Pro-Exploris 480 助力 FFPE 蛋白质组学研究

很明显,Evosep One LC 与 Orbitrap 质谱已然成为一种成功的组合。福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样品是医院大量复杂组织样本的常用储存方式,可以在室温下长时间保持样本的原始形态,也是疾病研究的重要资源。鉴于样本量巨大以及样品的复杂性,需要在蛋白组覆盖深度和整体的分析时长之间找到合理的平衡点。如图 2A,慕尼黑工业大学的 Bernhard Kuster 教授团队评估了前处理方式 nanoLC、FAIMS Pro 及质谱方法等多个因素 [2]。数据显示,当使用 44 min(30SPD) 或 88 min(15SPD) 方法,上样量为 600ng 时,蛋白和肽段检测量几乎达到饱和(图 2B、2C)。

根据优化后的方法,如图 2D,作者控制总检测时长一致,其中一个样品经 offline High-pH RP 分级成 4 个馏分后使用 Exploris 480 进行 44 min 的检测,另一样品组合 FAIMS-Exploris 480 的不同 CV 值分析(每次运行 5 个 CV,总共 10 个 CV),两种方式分别从相同的样品中鉴定到 5368 和 5247 个蛋白,且 90% 蛋白质的变异系数均 ≤ 15%(图 2E)。这表明样品前处理更加简洁的 Evosep One−FAIMS − MS/MS 分析方式可以获得与 bRP 分级相似的蛋白质组学深度和定量重现性。

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图 2. FFPE 蛋白质组学工作流程示意图 (A); 上样量对应的蛋白 (B) 和肽段 (C) 鉴定数目; Evosep One−FAIMS − MS/MS 分析方式可以获得与 bRP 分级的鉴定深度 (D) 和定量重现性 (E)。(点击查看大图)

03 Evosep-FAIMS Pro-Exploris 480 实测结果

Label free 定量和 DIA 技术是目前运用最广泛的两种蛋白质组学研究策略,拥有一个更高效的解析平台尤为重要。FAIMS Pro – Exploris 480 超高分辨质谱经近几年的市场检验,在 LFQ、TMT 和 DIA 定量工作及修饰样品等工作中都有着优异的表现。如图 3,近期我们采用 FAIMS Pro-Orbitrap Exploris 480 平台,结合 Evosep One 液相及 Evosep One 色谱柱,对 500ng Hela 酶解肽段进行了 15 min (60SPD) 或 44 min (30 SPD) 的快速分析。

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图 3. 测试所用的设备及色谱柱(点击查看大图)

结果如图 4 所示,FAIMS-DDA 采集模式下,采用 Proteome Discoverer 中 2-stage SequestHT 的方式对每个数据单独检索(不使用 Match Between Run),15 min 和 44 min 内可分别鉴定到超 3500 个及 5100 个蛋白;在 FAIMS-DIA 采集方式下,使用 Spectronaut 的 direct-DIA 检索方式,15 min 和 44 min 内可分别鉴定到约 4200 个及 5500 个蛋白,可实现蛋白质组的快速深度分析。

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图 4. 使用 DDA 及 FAIMS-DDA 在不同梯度长度下从 500ng hela 样品中鉴定的蛋白数 (A) 和肽段数 (B); 使用 DIA 及 FAIMS-DIA 在不同梯度长度下从 500ng hela 样品中鉴定的蛋白数 (C) 和肽段数 (D)。(点击查看大图)

总结:

全球顶尖的 Orbitrap Exploris™ 480 超高分辨质谱凭借其优越的分析性能,提供超高分辨率、灵敏度和稳定性,为组学研究者提供最强有力的可靠结果。Evosep One 稳定的前端色谱分离技术,标准化的操作流程,能够实现全平台更高效、更稳定的蛋白质组学深度解析,满足大规模临床样本等的高强度检测需求。

致谢:感谢杭州纽蓝科技有限公司(Evosep 大中华区总代理)在本次数据测试中提供的样机和相关技术支持

参考文献

[1]. Dorte B. Bekker-Jensen , et al., A Compact Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer with FAIMS Interface Improves Proteome Coverage in Short LC Gradients. Molecular & Cellular Proteomics, 2020, 19, 716–729
[2]. Stephan Eckert , et al., Evaluation of Disposable Trap Column nanoLC−FAIMS−MS/MS for the Proteomic Analysis of FFPE Tissue. J. Proteome Res. 2021, 20, 5402−5411

编辑: 朱卿

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