•「For quantitative comparisons, appropriate reagents, controls and imaging methods with linear signal ranges should be used」– Nature
•「Record how data were obtained, whether signal intensity was linear with antigen loading, and how protein loading was normalized」– Journal of Biological Chemistry
•「Normalize signal intensity to total protein loading (assessed by staining membranes for total protein) whenever possible」– Journal of Biological Chemistry
•「House-keeping proteins should not be used for normalization without evidence that manipulations do not affect expression」– Journal of Biological Chemistry
……
看到这些期刊的要求，你脑海中浮现的是什么呢？
刚进实验室的萌新：Normalize signal 是啥？
被实验折磨的要头秃师兄：哎，越来越多的杂志要求总蛋白归一化（TPN）了
升级打怪的大咖：有没有一种方法，让 TNP 数据获取更简单，数据分析更容易呢？
当然有啦！
上图片！
---一键拍摄膜上目标蛋白和 TPN 信号---
图 1. 用各种试剂处理 HCT116 细胞，使用 WB 和 TPN 进行检测的结果：人结肠癌细胞（HCT116）血清饥饿 24 小时，并用 LY294002（50μM，1 小时）、雷帕霉素（10nM，1 小时）和/或 BEZ235（500nM，1 小时）预处理。预处理后，在每个样品（12.8nM，15 min）中加入胰岛素样生长因子-1（hIGF-1）。细胞裂解，用 WB 法测定 p-AKT（Ser473）的相对含量，用 No-Stain 蛋白标记试剂进行归一化。IGF-1 诱导 AKT 磷酸化。雷帕霉素通过 IGF-1R 依赖机制抑制 mTOR 功能并诱导 AKT 磷酸化。LY294002 和 BEZ235 是 PI3K 途径和阻断 PI3 激酶依赖性 AKT 磷酸化的抑制剂。
上面的图片是 merge 在一起的图片，以下两张各个通道检测的结果。注意的是：使用 iBright，只需要拍摄一次，系统会自动拍摄这两个通道图片，是不是很方便？
化学发光通道
No-Stain 免染试剂进行膜上总蛋白染色结果
---直接计算出归一化因子---
归一化因子和归一化条带数据现在可以直接在 iBright 仪器上进行查看和/或作为报告或原始数据导出，在电脑上进行数据处理（iBright 提供免费电脑版软件）。报告可以导出为 PDF 文件。原始数据将自动导出为 CSV 文件。
图 2. 在 iBright 仪器上查看归一化因子。图右侧 Image Analysis
以图 1 结果为例，计算出各个通道的归一化因子，并以此进行目标蛋白的数据归一化处理.
将归一化处理的磷酸化-AKT 的结果以诱导倍数形式呈现（处理组对比未处理组）。
很多试剂都能染全蛋白，但不是染全蛋白的试剂都能用作 TPN，No-Stain 免染型蛋白标记试剂，可在膜上和各种胶上进行 TPN 染色，非常贴合实验者的具体需求。
这样就完事了吗？做标曲的肯定很关心线性度，做内源蛋白的肯定想问问灵敏度，光说不练假把式，有具体实验数据吗？
---iBright + No-Stain，让 TPN 灵活简单，既快又准---
让定量结果更准确
No-Stain 试剂可在更广的线性检测范围内实现精准的 TPN，避免了 HKP 信号饱和导致的无效结果；可检测到低至 20 ng 的蛋白条带，信号灵敏稳定；未结合蛋白的标记物不会自发荧光，确保优越的信噪比。
图. 使用 No-Stain 免染型蛋白标记试剂进行总蛋白归一化。与 HKP 相比，在 HeLa 裂解物中使用 No-Stain 试剂进行归一化的准确度更高。
使用方式灵活简单
No-Stain 试剂兼容任意凝胶类型以及 PVDF 和 NC 膜，可轻松融入现行 Western Blot 工作流程，标记操作也很简单。No-Stain 染色的信号可使用带有 UV、绿色 LED 、荧光光源（激发光范围～455-485nm）的多种成像仪来捕获，包括 iBright 成像系统。
图. 使用 No-Stain 试剂标记蛋白印迹的步骤
---关于 iBright 智能成像系统的 fun fact---
910 万物理像素，几乎是目前提供的采用冷 CCD 的最高像素了
3.69um x 3.69um 像素直径，让成像更细腻
抽屉电动开合，很多人喜欢这个充满未来感的开合声音
转盘其实是可以调整旋转的，一旦放歪，不用反复开合抽屉了
其实绿色 LED 对 EB 的激发效果要比紫外好
可 4 色荧光同时成像，要会巧用光谱查看器找荧光染料
机器上也可进行图像分析
准确的智能曝光时间，提前预测成像质量
开机一天屏幕也不热