关键词
翻译后修饰；DIA；谱图库；磷酸化；定量蛋白质组学
引言
数据非依赖采集（Data-Independent Acquisition, DIA）是当前最热门的质谱采集技术之一，它以非目标的方式将质量范围 分为若干窗口，依次并循环采集窗口内所有母离子的二级碎片[1,2]。DIA 与 SRM 类似，也是基于子离子（transition）定量， 相比传统蛋白质组学定量方法具有更好的选择性和更高的准确度。然而，目前 DIA 在翻译后修饰分析上仍有较大瓶颈。DIA 依赖于 DDA 建立谱图库，而 DDA 数据在搜库鉴定时，修饰位点定位错误的概率较高，特别是磷酸化修饰发生在常见的 S/T/Y 上，若肽段含有 2 个或以上位置接近的 S/T/Y，位点就容易找错。将含有错误位点信息的鉴定结果作为谱图库，就会导致翻译后修饰 DIA 解析结果的不可靠 [3]。因此，DIA 尚难用于大规模的翻译后修饰样本分析。
针对修饰位点的打分算法使修饰位点的定位更加准确，Proteome Discoverer 软件中整合的 phosphoRS/ptmRS 模块[4] 和 MaxQuant 软件的算法[5] 都可以实现位点可信度（Site Probability）的计算，从而获得可靠的位点定位信息。本文基于上述软件对翻译后修饰 DDA 数据进行位点可信度分析，筛选具有准确位点定位的谱图建立谱图库，导入 Skyline 软件，进而实现可靠的翻译后修饰 DIA 解析。将该流程应用于磷酸化样本 DIA 数据分析，成功提取 6401 条高可信度的磷酸化肽段（Q < 0.01），占谱图库肽段总数的 98.4%，其中可用于准确定量的肽段（CV < 20%）占 86.9%，有效解决了翻译后修饰 DIA 定量的难题。
实验条件
实验材料和方法
来源于大鼠组织富集的磷酸化样本，最终上样量为 700 ng/run，分别进行 DDA 和 DIA 采集，每种采集模式重复 3 遍。
色谱条件
纳流高效液相色谱仪：EASY-nLC 1000（Thermo Scientifific）
分析柱：纳流 C18 色谱柱（长 15 cm, ID 75 µm, 粒径 3 µm）
流动相：A：0.1% 甲酸水溶液；B：0.1% 甲酸乙腈溶液
梯度：0–3 min, 3–7% B; 3–95 min, 7–22% B; 95–113 min, 22– 35% B; 113–116 min, 35-90% B; 116-120 min, 90% B
流速：300 nL/min