前 言
欧易隆重推出 10× Genomics Chromium™ 单细胞转录组服务后，受到众多科研人员的关注和青睐。今天继续给大家解读一篇 10× Genomics 单细胞转录组的研究案例，该文章于 2018 年发表于《Nature Cell Biology》，是单细胞胚胎发育领域的经典文章，并且该文章做了单细胞转录组的后续功能验证工作，因此具有很高的参考价值。
基本信息
材料：小鼠胚胎
方法：10× Genomics 单细胞转录组测序
期刊：Nature Cell Biology
影响因子：19.064
研究背景
在原肠胚形成过程中，三个胚层的细胞类型已经确定并为组织发生、器官发生打下基础。然而，由于细胞数量的限制和缺少分子标志物，这一关键发育时期的分子机制研究仍有待研究。
研究目的
通过单细胞转录组测序探究原肠胚形成过程中细胞分子标志物、功能及作用机理。
技术路线
技术框线示意图
研究内容
1. 胚胎细胞亚群聚类
收集得到 E8.25 时期的小鼠胚胎并进行 10× Genomics 单细胞转录组测序，共得到 19,396 个细胞用于后续分析。图 1.b 展示了平均每个细胞测得的 UMI 数目和基因数。图 1.c 为胚胎细胞亚群聚类结果，该图为文章的核心内容。结果将该阶段胚胎细胞分为 33 个亚群共 20 个不同的细胞类型。下一步作者确定了每个细胞群中特异高表达的基因（图 2），除了已知的 marker 基因，该研究还发现了胚胎发育中没有被报道过的特异高表达基因，这些基因为鉴定细胞类型提供了参考。
图 1 | 胚胎细胞群聚类结果
图 2 | 各细胞类型的特异高表达基因鉴定
2. 前肠亚群聚类
在胚胎发育过程中，内胚层会发生一系列的形态上的变化，主导了多种器官的形成。对于该研究鉴定出的细胞类型，作者希望通过进一步聚类，挖掘可能存在的细胞调控和分化作用。这里作者以前肠细胞群为例，对前肠细胞群进一步亚群聚类。结果如图 3 所示，作者将前肠细胞共分为 3 个亚群，并通过相关 marker 基因的表达确定 3 个亚群的类型，即：早期内胚层细胞、甲状腺祖细胞和肝祖细胞。
图 3 | 前肠亚群聚类
3. 体节发生过程中基因的表达特征
体节发生过程中涉及到胚胎体的分割和一系列相关基因的节律性表达（图 4）。作者在该部分探究了体节发生过程中前体节中胚层基因的表达特征，在单细胞水平上鉴定了 93 个节律性表达的基因，与预期相符（图 5）。
图 4 | 小鼠体节发生示意图
图 5 | 单细胞转录组确定体节发生过程 93 个节律性表达的基因
4. 内皮细胞亚群特征分析
对于分离得到的大部分细胞类型，都会特异性的富集在成年人的某一个器官中。但是对于内皮细胞，往往广泛存在于身体的各个部位。因此，作者试图对内皮细胞进行聚类。通过内皮细胞的生成来源和成熟度，作者将内皮细胞共分为 4 类，如图 6 所示。
图 6 | 内皮细胞亚群分析
5. 白三烯生物合成途径促进血液形成
对于上述分类得到的内皮细胞亚群，作者进一步探讨了血源性的内皮细胞和红细胞祖细胞（EMPs）的表达特征，发现这两类细胞高表达 Alox5 和 Alox5ap。Alox5 和 Alox5ap 常在花生四烯酸产生白三烯的位置出现，因此作者认为这个通路可能和血液发展相关，最后作者体外使用 EMP 细胞和小鼠胚胎干细胞诱导血源性的内皮细胞进行功能验证，发现随着白三烯浓度的增加，血源性的内皮细胞克隆数升高。
图 7 | 白三烯生物合成途径促进血液形成
参考文献
Doi：10.1038/s41556-017-0013-z