前言
单细胞转录组测序一个非常重要的研究方向就是单细胞分辨率下重新定义细胞类型，挖掘得到新的细胞亚群和 marker 基因。今天为大家解读一篇单细胞转录组测序在视网膜神经节细胞中的应用案例，该文章通过 10 × Genomics 单细胞转录组测序获得了六万多个神经节细胞的表达谱，聚类得到了 40 个神经节细胞亚群，探讨了神经节细胞亚群的功能、发育进程以及鉴定了神经节视网膜细胞的 marker 基因。
基本信息
材料：小鼠视网膜
方法：10× Genomics 单细胞转录组测序
期刊：nature communication
影响因子：12.353
研究目的
重新定义视网膜神经节细胞类型及鉴定对应的 marker 基因
实验流程与技术路线
图 1 | 实验流程示意图
取出生后 5 天的小鼠左眼和右眼的视网膜，解离成单细胞悬液后进行免疫抗体包被筛选（Immunopanning），筛选得到视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）。
图 2 | 技术框线示意图
研究内容
1. 鉴定神经节细胞亚群
图 3 | 鉴定神经节细胞亚群
通过聚类分析将 6,225 个 RGCs 分为了 40 个亚群（Fig 3.d），这些 RGCs 均表达视网膜神经节细胞的 marker 基因 Thy1，与前期免疫抗体包被筛选结果一致。整体看这 40 个 cluster 的基因表达谱都比较相似，任意簇与簇之间的相关系数均大于 0.9（r ＞ 0.9, Pearson）（Fig 3.f 和 Fig 3.g）。
2. RGCs 在左右眼球分布的偏重分析
图 4 | 左眼和右眼中 RGCs 的分布特征分析
因为 RGCs 的来源不同（左眼和右眼），作者想要了解左眼和右眼的 RGCs 是否存在分布以及表达上的差异性。作者发现大部分 cluster 中左右眼球的 RGCs 占比相似以及表达谱相似（Fig 4.a、Fig 4.b 和 Fig 4.c）。然而，作者发现尽管 cluster 40 细胞总数比较少，但是这个 cluster 的细胞主要是右眼中的细胞，左眼中非常少。说明 cluster 40 所代表的视网膜神经节细胞功能可能在右眼中起到一个支配性的作用。
3. 亚群功能挖掘及 marker 基因鉴定
图 5 | cluster 基因表达特征分析
比较了左右眼球 RGC 中的不同之后，作者主要从三个方面进行比较不同的 cluster，即：1. 表达的基因数量；2. 基因的表达量；3.cluster 的细胞数量。结果发现 culster 1 和 culster 13 这两个亚群是细胞数目最多的两个亚群，但是基因的表达数目和表达量反而是最低的。一般来说，细胞的体积越大，它的转录可能越活跃，这里作者发现 culster 1 和 culster 13 虽然细胞数目上比重较大，但是基因表达较低，因此作者推测这两个 culster 可能是微型视网膜神经节细胞。
图 6 | marker 基因鉴定及原位杂交验证
下一步，作者鉴定了各亚群的 marker 基因，并通过免疫荧光原位杂交验证出 Runx1 和 Fst 分别可以作为 cluster 27 和 cluster 3 的 marker（Fig 6）。对 40 个 cluster 构建系统发育树，作者将 40 个 cluster 分为 10 类，这 10 类还可以进一步聚成 4 类（Fig 7）。这样的聚类结果，也可能代表着视网膜神经节细胞的发育过程，即先分化为 4 类，再分化成 10 类，最后进一步分化行成 40 种神经节视网膜细胞。
图 7 | RGCs 构建系统发育树结果展示
4. 轴突再生调节基因表达分析
图 8 | 轴突再生调节基因表达热图
临床轴突再生治疗过程中，不同视网膜神经节细胞的轴突再生修复能力区别较大，作者想要知道某些 cluster 是否富集了提高轴突生长能力的基因或者是抑制轴突生长能力的基因。结果发现不同 cludter 间轴突再生调节基因表达差异较大（Fig 7）。在这些轴突再生调节基因中作者对 KLP9 非常感兴趣，因为前期的研究结果发现某些 RGCs 沉默 KLP9 可以促进轴突再生，而这里作者通过单细胞测序直观的确定了 anti-KLP9 shRNA 的作用靶标细胞为 cluster 7、cluster 20、cluster 27 以及 cluster 34。
参考文献
Rheaume B A, Jereen A, Bolisetty M, et al. Single cell transcriptome profiling of retinal ganglion cells identifies cellular subtypes[J]. Nature communications, 2018, 9(1): 2759.
DOI: 10.1038/s41467-018-05134-3