单细胞和 TCR 测序揭示了调节性 T 细胞的表型图谱

前言

CD4⁺ 调节性 T 细胞（T_reg）在保持体内免疫平衡中起关键作用，他们的表型异质性反映了环境多样性以及它们所调节的靶细胞的多样性。因此，本文以小鼠的淋巴组织和人血为材料，用单细胞转录组、激活检测和 TCR 分析来探究调节性 T 细胞和传统的 CD4⁺FoxP3-T 细胞（T_conv）的表达谱。

实验方法

1、实验材料：小鼠、人-血

2、single-cell RNA-seq 方法：Indrop, CEL-seq, 10X Genomics

结果与分析

1.CD4⁺ T_reg 和 T_conv scRNA-seq 数据分析

为了发现细胞的小亚群和特异性基因，对 T_reg 和 T_conv 做了 Indrop 单细胞转录组分析。用流式细胞仪从 Foxp3 ^gfp 小鼠中分选出 CD4⁺TCRβ⁺GFP⁺T_reg 和 GFP-T_conv 细胞用于单细胞转录组文库构建（Fig.1a）。为了降低不同实验批次的影响和评估实验结果的稳定，本文还用了 10x Gnomics 和 CEL-seq 的方法进行单细胞转录组实验。

Fig. 1 | T_reg and Tconv scRNA-seq datasets

每个单细胞中检测到了 1751unique mRNA 分子（代表 787 gene），共检测到 16720 genes（Fig.1b）。与预期一致，2 个重要的 T_reg  marker--Foxp3 和 Il2ra 在不同的 T_reg 细胞中表达，但在 Tconv 细胞中几乎未表达（Fig.1c）。

2、CD4⁺ T_reg 和 T_conv 细胞之间的转录关系

用 tSNE 分析 T_reg 和 T_conv 细胞的转录情况，发现 T_reg 主要分布在 D 区，T_conv 主要分布在 E 区，但他们也有一些重叠，如在 E 区发现了一些 T_reg 细胞（「furtive」T_regs），反之亦然。大部分「furtive」T_regs 可以检测到 Foxp3 表达，且和其他的 T_regs 表达水平相似（Fig.2c）。

在 E 区，T_regs 的信号基因过表达，表达量远高于 T_conv 细胞；但在 E 区之外，T_regs 的信号过表达转移到了 Il2ra 和 Ikzf2 等基因。

对分散区域（A-C 区）的基因表达进行分析，在 A 区发现 T_regs 和 T_convs 过表达基因与 B 细胞淋巴结相关（如 Tfollicular helper (Tfh) 和 Tfrcells）；在 B 区，T_regs 和 T_convs 的上调基因与 TCR 的早期响应有关（Nr4a1, Egr1, Egr2,Myc and Dusp2），表明在这两种细胞中 TCR 可能有相似的启动程序。

Fig.2 | Some T_regs and T_convs show closely relatedtranscriptomes.

d,e,f 中的红色-上调，蓝色-下调

3、脾脏 T_reg  细胞的异质性围绕着几个不同的极点

如图 a,b 所示，将脾脏 T_reg 细胞分为 6 个 clusters。作者分析发现，cluster4-6 中的 Treg 细胞可能处于休眠状态，而 cluster1-3 中的 T_reg 细胞可能处于激活状态（通过一些与 Treg 细胞休眠相关基因的表达水平判断，Sell,Ccr7）。此外，cluster1-3 可代表激活表型的 2 个极点，cluster3 中细胞主要表达早期细胞激活的基因（Nr4a1, Egr1, Egr2,Dusp2），从而诱发了 TCR-mediated 激活。

根据 a 中定义的基因的表达推测每个单细胞可能的状态做 CAP 图（图 c），大部分 T_reg 细胞能清晰地投射到一个主簇中，尤其是处于激活状态的 cluster1-3，而 cluster4 较分散。tSNE 图发现休眠状态的 cluster 映射到核心 T_reg 区域，而激活的 cluster 映射到与 T_convs 重叠的边缘区域 (A-C)，表明 T_reg 激活导致了与 T_convs 的部分重叠。

scRNA-seq 数据预测 CXCR3 主要由 CD62L^lo 激活的 T 细胞显示，且 CXCR3 和 NR4A1 在很大程度上相互排斥。这些预测最终被证实，CXCR3 在 CD62l^loT_regs 上表达，CXCR3 在 NR4A1-T_regs 上表达最高。对 T_reg 细胞效应分子表达频率和分布情况进行判定，发现效应分子的表达无相互排斥，且鉴定出一个共表达效应分子。Il2ra 和 Ctla4 是最常见的抑制分子。相反，Lrrc32 和 Tgfb1 存在相互偏好性表达。Il10 和 Areg 在激活的簇中优先表达，但非常罕见，这与它们优先部署在组织 T_regs 或炎症部位相一致。因此，脾脏 T_reg 细胞采用连续的状态，围绕一个休眠状态和 2 个激活状态，从而有独特的表型和效应功能。

Fig. 4 | Resting andactivated T_reg states identified by scRNA-seq

4、TCR  信号在影响 T_reg 细胞状态中的作用

Nr4a1 是一种转录因子，在 T 细胞激活时 Nr4a1 的表达以与 TCR 信号强度成正比的方式被快速诱导。因此作者利用 Nr4a1 ^gfp 报告小鼠，并结合 T_reg 单细胞数据将 GFP 的表达分为 3 个区，发现 Nr4a1 的出现频率和表达水平与 T_reg 细胞的来源一致。不同 Nr4a1 表达水平的 Treg 细胞形成了一个从低到高表达的轨迹。

Fig. 5 | T_reg states associated with different TCR-signaling strength

激活的 T_reg 分布随 NR4A1-GFP 强度的改变而显著变化，cluster3 中的细胞比例随 GFP 增加，而 cluster1 和 2 中的细胞比例降低。

因此，在生理环境和没有炎症刺激的情况下，TCR 信号水平不影响激活的 T_reg 细胞的比例，但显著地扭曲了它们的表型选择。

5、人和鼠的 T_reg 细胞有相似的异质性模式

最后，作者研究了小鼠脾脏 T_reg 的结论是否也适用于人类细胞。用流式分选出人血液的 T_reg 和 T_convs 细胞，并进行 scRNA-seq。T_reg 和 T_convs 细胞之间的异质性和相互关系及其基因表达等方面，与小鼠的结果非常相似。

T_reg 和 T_convs 细胞簇是分开的，但 furtiveT_regs  存在于 Tc_onvs 细胞的的主要区域（A 区，高达 55%，鼠的只有 26%）。furtiveT_regs  细胞也表达了 FOXP3，尽管其表达水平低于其他的 Tregs 细胞。

Fig. 6 | Similitudes in human and mouse T_reg heterogeneity

参考文献

AZemmour, D., Zilionis, R., Kiner, E., Klein, A. M., Mathis, D., & Benoist, C. (2018). Single-cell gene expression reveals a landscape of regulatory T cell phenotypes shaped by the TCR. Nature immunology, 19(3), 291-301.