「斑马鱼」首次揭示干扰素λ受体突变导致临床遗传性耳聋

2 月 16 日（正月初一），国际医学遗传学期刊 Journal of Medical Genetics  在线发表了解放军总医院的科研成果「Mutation of IFNLR1, an interferon lambda receptor 1, is associated with autosomal-dominant non-syndromic hearing loss」，揭示了 IFNLR1 在听觉系统中的重要作用，IFNLR1 突变与遗传性听力损失（ADNSHL）密切相关。

本研究中斑马鱼模型构建及表型分析是在上海南方模式生物斑马鱼平台上完成的。

遗传性听力丧失具有高度遗传异质性的特点，几百种编码多种蛋白质的基因突变都可能与之相关。而常染色体显性非综合征性听力丧失（ADNSHL）的患者占到遗传性听力丧失者的 20% 左右，他们通常表现为由最初的高频率听力损失发展到舌下进行性听力损伤。迄今为止，已经绘制了 59 个 ADNSHL 基因位点，并且已经确定了 36 个致病基因。

干扰素（IFN）λ受体 1（IFNLR1，MIM 607404）属于 II 类细胞因子受体家族，负责识别细胞外环境中的细胞因子和 IFN，以及启动细胞内信号传导级联，从而导致一系列反应，例如造血、免疫系统调节和细胞生长和发育。然而，IFNLR1 在听觉系统中的功能尚未描述。

研究人员使用遗传连锁分析和全外显子组测序的组合来鉴定作为常染色体显性遗传性听力障碍的原因的 IFNLR1 中的突变，结果发现 IFNLR1 c.296 G> A（p.Arg99 His）很可能是该家族中遗传性听力障碍的致病基因突变。

Figure 1. Identification of a mutation in IFNLR1 causing ADNSHL. 

接下来研究人员进一步评估了 IFNLR1 基因在小鼠中的表达，绘制了出生后 30 天的小鼠内耳中 Ifnlr1 表达模式的示意图（Fig2A）。在耳蜗中，Ifnlr1 在柯蒂氏器，赖斯纳氏膜，基底膜，螺旋韧带，内沟细胞，内柱细胞和外柱细胞中表达（Fig2B）。 Ifnlr1 在内毛细胞（IHCs）和外毛细胞（OHCs）纤毛中高表达，与鬼笔环肽（标记耳蜗基底膜外毛细胞的表皮板）部分共定位（Fig2 G）。利用可特异性标记神经纤维和神经元的神经丝重链抗体（NF200）发现 Ifnlr1 在耳蜗神经纤维和螺旋神经节神经元中共定位（Fig2D，E）。在柯蒂氏器的大多数细胞的细胞质和细胞核质中 Ifnlr1 均高表达；与 IHCs 不同，Ifnlr1 在 OHCs 的核质中没有表达（Fig2C，H-J）。并且观察到 Ifnlr1 和鬼笔环肽在前庭上皮壶腹部有共定位的表达（Fig2F）。

Figure 2. Immunofluorescence analysis of ifnlr1 expression in the inner ear of P30 mice. 

利用斑马鱼 Morpholino（MO）Knockdown 技术，获得 ifnlr1 敲低斑马鱼模型（Fig3A，B）。

ifnlr1 敲低后斑马鱼的早期发育中（从 32 hpf 到 4dpf）没有发生显著变化。在对照和 ifnlr1-e4i4-MO 注射的鱼中，在节间血管（ISV）中的循环看起来正常。 敲低 ifnlr1 不会诱导器官特异性凋亡或巨噬细胞迁移，这表明细胞凋亡和炎症可能不是导致毛细胞数量减少的原因。

而在发展的后期阶段，ifnlr1 敲低引起了斑马鱼鳔充气异常，同时肠腔面积扩大（Fig3C-F）。（鱼鳔与人类的肺是同源器官，鱼鳔异常说明 ifnlr1 基因突变也可能在临床上影响人类的肺功能。）与正常对照相比，ifnlr1 敲低斑马鱼的神经丘数量减少（Fig3I，M）。使用四种标记，GFP（毛细胞），SOX2（支持细胞），BrdU（增殖细胞）和 DAPI（核），在 6dpf Tg(Brn3c：mGFP) 转基因斑马鱼中计数每个神经丘的毛细胞和支持细胞。ifnlr1 敲低斑马鱼幼鱼侧线神经丘中毛细胞和支持细胞少于野生型（WT）（Fig3O），而且突变体中 BrdU 阳性细胞的数量低于 WT（Fig3O，R），说明毛细胞和支持细胞的损失与细胞增殖减少相关。

Figure 3. Phenotypes of ifnlr1 zebrafish morphants. 

通过将斑马鱼 ifnlr1 mRNA 与 ifnlr1 MO 共注入单细胞阶段胚胎以拯救由 MO 引起的异常。拯救实验结果显示，野生型 ifnlr1 mRNA 可以在很大程度上挽救 ifnlr1-e4i4-MO 诱导的鱼鳔充气异常表型，以及 6dpf 时斑马鱼毛细胞和头部神经丘的减少。这些结果提示 IFNLR1 突变导致 JS4842 家族的听力损失（Fig4）。

Figure 4. Coinjection of ifnlr1 mrna from non-mutant zebrafish rescued the phenotypes of non-inflated SB, hair cell loss and head neuromast loss (6 dpf) induced by ifnlr1-e4i4-MO.

通过 realtime-PCR 检测发现，细胞因子受体家族成员 b4（crfb4，也叫白细胞介素（IL）10 受体 2，il10r2），jak1，酪氨酸激酶 2（tyk2），stat3，stat5，这些 Jak/STAT 信号通路有关的基因在 ifnlr1 敲低后被上调（Fig5）。从而推测 ifnlr1 突变可能通过 Janus 激酶（Jak）1 /信号转导和转录激活因子（sTAT）3 信号通路促成听力损失。

Figure 5. Jak1/Stat3 signalling pathway were upregulated in ifnlr1-morphant zebrafish.