「斑马鱼」研究基因功能，就是快准狠

2013 年 4 月，英国桑格研究所（Sanger Institute）协同全球最权威的 14 家斑马鱼研究机构，将斑马鱼全基因组和人类基因组进行比较分析发现，人类 2 万多个蛋白编码基因至少可以在斑马鱼体内找到 1 个同源基因与之对应。

在前两期斑马鱼专题中我们已经介绍了斑马鱼作为模式生物的诸多优势、以及斑马鱼在药物研发中的应用。今天小编就通过实际案例来说说斑马鱼在基因功能研究中的应用。

在斑马鱼中，我们可以通过简单且有效的反向遗传学手段，在斑马鱼基因组中实现特定基因的突变、过表达或缺失，例如：通过注射体外合成的 mRNA 实现目的基因的过表达，或者通过注射反义吗啉环寡核苷酸敲减目的基因的表达（Morpholino Knockdown），并通过观察表型推测目的基因的功能。

名词解释

Morpholino Knockdown

反义吗啉环寡核苷酸（Morpholino）是稳定的人工合成的核酸类似物，通过碱基互补配对与 mRNA 结合，阻断蛋白翻译或 mRNA 剪切，导致蛋白产物减少或缺失。

举个栗子

Case1

斑马鱼体内实验有力地佐证了编码 ADA2 蛋白的 CECR1 基因遗传突变导致早发型中风和血管病变，这种新的遗传缺陷被称为 ADA2 缺失或 DADA2。这项研究已经发表在顶级医学杂志新英格兰医学杂志上。

美国 NIH 研究人员在临床上发现 CECR1 基因（该基因编码 ADA2 蛋白）遗传突变可能在童年早期造成不定期发烧症状、皮疹和经常性中风。

图 1. Clinical Findings and Pedigrees of Patients with Deficiency of Adenosine Deaminase 2 (ADA2) （图片来自 ref1）

利用 Morpholino knockdown 技术在斑马鱼中敲低 CECR1 同源基因 Cecr1b，研究人员发现 Cecr1b 基因缺失影响了血管形成与完整性，斑马鱼表现出颅内出血的症状；而这种表型可以通过注射未突变的正常人 CECR1 基因 mRNA 得到拯救。

图 2. Evidence ofLoss-of-Function Mutations in ADA2 （图片来自 ref1）

再举个栗子

Case2

中科院昆明动物所-张亚平院士课题组在某家鸡品种中克隆获得了 VIT(vitrin) 基因，VIT(vitrin) 基因在物种进化上高度保守，斑马鱼体内存在一个与家鸡 VIT(vitrin) 基因对应的同源基因 ch1073-291c23.1 (VIT)。

图 3. VIT knockdown 斑马鱼表型分析（图片来自 ref2）

采用 Morpholino Knockdown 技术对斑马鱼 VIT 基因进行敲低，通过表型分析，首次发现该基因在斑马鱼早期生长发育（体长），脑细胞/眼睛凋亡，心脏凋亡等方面扮演重要功能。该研究斑马鱼体内实验由上海南方模式生物斑马鱼技术团队完成，完整研究成果发表于 2016 年 5 月的 Nature 子刊《Cell Research》。

最后举个过表达的成功案例

Case3

小肠毛细血管扩张症 Gastrointestinal vascular malformation (GIVM)，在临床上发病概率很低。小肠毛细血管扩张症患者之所以会发生出血，主要是小肠血管出现异常增生，新生的无效血管发生渗漏，最终导致出血。该病的发病机制尚不清楚。沙利度胺（Thalidomide）在临床上已用于治疗小肠毛细血管扩张症，但对该药物治疗机制也没有详细的研究。

图 4. (A) The expression of HIF-1α and HIF-2α in gastrointestinal vascular malformations and normal vessels. Red arrow: strongly positive; Black arrow: weakly positive; Blue arrow: negative. (B) Percentages of positive and negative vessels in GIVM and normal tissues. **P < 0.01.（图片来自 ref3）

上海南方模式生物与上海交通大学附属仁济医院消化科合作，利用斑马鱼模型首次过表达人源 HIF-2α，发现 HIF-2α可以成功诱导斑马鱼肠下静脉（SIVs）异常增生，该模型成功复制了人类小肠毛细血管扩张症。

图 5. HIF-2α过表达斑马鱼肠下静脉增生

(D) Fluorescence microscope observations of subintestinal vein sprouting in normal and HIF-2α -overexpressing zebrafish. * Indicates subintestinal vascular sprouts. HIF-2α overexpression significantly increased the number of subintestinal vascular sprouts. ** P < 0.01 vs.control plasmid. (E) Dual luciferase reporter gene assay demonstrated that HIF-2α enhanced VEGF promoter activity. ** P < 0.01 vs.control plasmid.（图片来自 ref3）

随后利用该诱导模型给与沙利度胺（Thalidomide）治疗，发现沙利度胺（Thalidomide）可以有效缓解了这一临床症状。该斑马鱼项目，首次证明了人类 HIF-2α过表达，是导致小肠毛细血管扩张症患者出血的直接风险因素，首次证明了经过沙利度胺（Thalidomide）治疗可以有效逆转 HIF-2α过表达诱导的肠下血管过度增生。该研究成果发表于 2016 年 6 月的《Scientific Reports》。

图 6. (D) Fluorescence microscope observations of the effect of thalidomide at different concentrations on vascular development in zebrafish with HIF-2α overexpression. ** P < 0.01 vs.HIF-2α（图片来自 ref3）

图 7. The expression of HIF-2α(EPAS1), VEGF, Notch1a, Notch1b, Notch2, Notch3, and DLL4 in the 

zebrafish model. * P < 0.05,  ** P < 0.01.（图片来自 ref3）

看了这些案例，是不是觉得小小斑马鱼其实也很不简单呢～ 

希望我们这三期斑马鱼专题的介绍能带给你一些新的思路和启发。

有任何想法或问题都欢迎给我们留言，或电话与我们联系：400-728-0660。

参考文献

[1] Zhou Q, Yang D, et al. Early-onset strokeand vasculopathy associated with mutations in ADA2. N Engl J Med. 2014 March 6;370(10): 911–920.

[2] Wang MS, Zhang RW, et al. Positiveselection rather than relaxation of functional constraint drives the evolutionof vision during chicken domestication. Cell Res. 2016 May;26(5):556-73.

[3] Feng N, ChenH, et al. HIF-1α and HIF-2α induced angiogenesis in gastrointestinal vascularmalformation and reversed by thalidomide. Sci Rep. 2016 Jun 1;6:27280.