前言：阅读全文了解眼部遗传疾病与基因治疗干预方法，学会选择合适的眼部基因治疗工具，让所有眼睛都明亮起来，参与文末答题赢好礼！
一、眼球简介
眼是一个可以感知光线的器官。眼睛通过把光投射到对光敏感的视网膜成像，在那里，光线被接受并转化成信号并通过视神经传递到脑部。通常眼睛是球状的，当中充满透明的凝胶状的物质，有一个聚焦用的晶状体，通常还有一个可以控制进入眼睛光线多少的虹膜。
图 1：眼球结构示意图
眼球壁主要分为外、中、内三层。外层是纤维膜，由角膜、巩膜组成。角膜含丰富的神经，感觉敏锐。角膜除了是光线进入眼内和折射成像的主要结构外，也起保护作用，并是测定人体知觉的重要部位。巩膜为致密的胶原纤维结构，不透明，呈乳白色，质地坚韧。中层又称葡萄膜，色素膜，具有丰富的色素和血管，包括虹膜、睫状体和脉络膜三部分。内层为视网膜，是一层透明的膜，也是视觉形成的神经信息传递的第一站，具有很精细的网络结构及丰富的代谢和生理功能。
角膜分为五层，由前向后依次为：上皮细胞层（epithelium）、前弹力层（laminaelasticaanterior）、基质层（stroma）、后弹力层（laminaelasticaporterior）、内皮细胞层（endothelium）。上皮细胞层厚约 50um，占整个角膜厚度的 10%，由 5-6 层细胞所组成，周边部上皮增厚，细胞增加到 8-10 层。前弹力层是一层特殊的膜，在电镜下观察显示该膜主要由胶原纤维所构成。基质层由胶原纤维构成，厚约 500um，占整个角膜厚度的 90%，包含 200-250 个板层，相互重叠在一起。后弹力层是角膜内皮细胞的基底膜，很容易与相邻的基质层及内皮细胞分离，非常坚固，对化学物质和病理损害的抵抗力强。内皮细胞为一单层细胞，约由 500000 个六边形细胞所组成，细胞高 5um，宽 18-20um，细胞核位于细胞的中央部，为椭圆形，直径约 7um。
视网膜（retina）居于眼球壁的内层，是一层透明的薄膜。组织学上视网膜分为 10 层，由外向内分别为：色素上皮层，视锥、视杆细胞层，外界膜，外颗粒层，外丛状层，内颗粒层，内丛状层，神经节细胞层，神经纤维层，内界膜。视网膜细胞主要有：视锥细胞、视杆细胞、双极细胞、单拮抗细胞、神经节细胞、视网膜特化感光神经节细胞。
眼内腔包括前房、后房和玻璃体腔。眼内容物包括房水、晶体和玻璃体。三者均透明的，与角膜一起共称为屈光介质。玻璃体有屈光作用，也起支撑视网膜的作用。玻璃体后脱离（PVD）指玻璃体后皮质从视网膜内表面分离。通常在玻璃体液化的基础上发生，随着玻璃体中央部的液化腔扩大，玻璃体后皮质层变薄并出现裂口，液化的玻璃体通过裂口进入玻璃体后间隙，使后皮质与视网膜迅速分离。
二、主要眼部疾病
1、先天性黑蒙症
先天性黑蒙症（Leber's congenital amaurosis, LCA），是发生最早、最严重的遗传性视网膜病变， 出生时或出生后一年内双眼锥杆细胞功能完全丧失，导致婴幼儿先天性盲。LCA 占遗传性视网膜病变的 5% 以上，是导致儿童先天性盲的主要疾病（占 10%-20%）。多呈常染色体隐性遗传，临床上以眼球震颤、固视障碍、畏光、指压眼球为特征。眼底检查早期多为正常，随着病变进行性进展，数年后可见眼底椒盐样色素沉着、骨细胞样色素、视网膜血管狭窄、广泛视网膜色素上皮和脉络膜萎缩。视网膜电图表现为 a、b 波平坦，甚至消失。可伴有圆锥角膜、远视、发育迟缓和神经系统异常等。有研究发现数种与 LCA 相关的致病基因，主要包括 RPE65，GUCY2D, CRX, RPGRIP1，CRBI 和 AIPL1 等。
Spark 公司的 voretigene neparvovec 针对的是由 RPE65 基因遗传缺陷引起的视网膜疾病，它将携带 RPE65 基因的腺相关病毒（AAV-RPE65）直接注射到患者的眼底。该疗法成功地阻止了患者向完全失明发展的过程，有效地改善了患者的光感和视觉。目前这一药物已经顺利完成临床 III 期的研究，预计 2017 年会提交 FDA 审批。如果得到批准，这一药物将成为 FDA 批准的第一例 AAV 药物。
2、增龄性黄斑变性
增龄性黄斑变性（age-related macular degeneration，ARMD），亦称老年性黄斑变性（senile macular degeneration，SMD）是与年龄相关的致盲的重要眼病之一。在英、美等发达国家是 65 岁以上老年人致盲眼病中最常见的原因。在我国，由于人口趋于老龄化，其他致盲原因得到或加强了控制，老年性黄斑变性亦日益成为重要的致盲性眼病。 根据临床与病理表现，老年性黄斑变性分为 2 型，即萎缩型（atrophic senile macular degeneration）与渗出型（exudative senile macular degeneration）。萎缩型老年性黄斑变性主要为脉络膜毛细血管萎缩、玻璃膜增厚和视网膜色素上皮萎缩等所致的黄斑区萎缩变性；渗出型老年性黄斑变性主要为玻璃膜破坏、脉络膜血管侵入视网膜下形成新生血管，导致视网膜和（或）色素上皮有浆液和（或）出血。
RGX-314 是由 Regenxbio 开发的针对湿性老年黄斑变性的基因疗法，它通过腺相关病毒将编码一种单抗药物 ranibizumab（血管内皮细胞生长因子抑制剂）（AAV-anti-VEGF）的基因送到患者眼底。目前该药正在进行临床 I 期试验。
3、视网膜劈裂症
X 连锁视网膜劈裂症（XLRS）是由视网膜劈裂蛋白 1（RS1）基因突变引起的一种遗传性眼底疾病。XLRS 小鼠模型的建立为开展人类 XLRS 的发病机制和治疗提供了理想的模型。研究表明，当 RS1 基因发生突变时，RS1 蛋白的分泌和黏附功能发生障碍导致视网膜发生劈裂。利用腺相关病毒（AAV）8 型载体和具有 3 点突变的 AAV2 型载体通过玻璃体腔注射治疗 XLRS 的基因治疗临床Ⅰ期试验已经开始。随着具有更高转染效率可以通过玻璃体腔注射转染更多视网膜细胞的载体以及相关技术的发展。
4、全色盲
全色盲是一种严重的先天性、致盲性、遗传性视网膜疾病。已发现有 4 个基因突变与其发病相关，分别是 GNAT2、CNGA3、CNGB3 及 PDE6C。全色盲患者起病虽早，但病情进展十分缓慢，经基因治疗后视网膜功能恢复效果明显，因而受到研究者的极大关注，有望成为继 Leber 先天性黑蒙症之后，又一个即将进入临床试验的视网膜遗传性疾病。其中 CNGA3 和 CNGB3，分别编码离子通道的α和β亚单位，其对于视网膜内视锥细胞的正常功能是必需的。 约 75% 的全色盲患者在这两种基因之一中具有突变； 其余的病例来自几个其他基因之一的突变。 在狗和绵羊的全色盲模型中的临床前研究表明，在接受传送一个 CNGA3 或 CNGB3 的功能性拷贝的基因治疗之后，动物能够更好地通过迷宫。
三、最合适的病毒工具
腺相关病毒
血清型选择：AAV2/2、AAV2/8、AAV2/DJ
图 2：AAV2/2 感染小鼠玻璃体腔
病毒类型及滴度 AAV-GFP，2 型，滴度 10^12vg/ml
感染动物：C57 小鼠，8 周龄
感染部位：视网膜
注射方法及体积：玻璃体腔注射，3ul
检测方法：感染三周，wholemount，荧光显微镜检测
四、病毒注射方法
玻璃体腔注射
图 3：玻璃体腔注射示意图
1、麻醉：4.3% 水合氯醛 0.01 ml/g；
2、散瞳，建议双眼散瞳，以防一眼出现意外时可以迅速换眼；
3、保持眼表湿润；小鼠晶体非常敏感，温度变化、麻醉药物、眼压以及眼表干燥等都会导致小鼠晶体混浊；当然，这种混浊大概 2 小时以后恢复正常；
4、抗生素眼药水、表麻药术前滴眼；
5、调整小鼠头位。小鼠的头是三角形的，因此需要使用棉球或者其他垫一下头部让小鼠眼球保持角膜缘水平位；
6、注射位置：理论上是角膜缘后 1 mm，可以根据情况进行调整；
7、注射切口：推荐小鼠可以用 ALCON 的 10-0 针做切口，非常整齐，33 G 的针进去水密非常好。也可以用破囊针。切口越整齐，跟你的针越匹配，越不易渗漏；
8、进针：针尖垂直进入，随后倾斜。这一步非常重要，小鼠眼球小，晶体球形，倾斜角度小了会损伤晶体，大了会扎上视网膜，出血；
9、注射：缓慢推注。要是迅速推注你取材时会发现视网膜散在出血点，可能干扰试验结果。推针以后留针 0.5-1 min，迅速出针；注射结束后记得检查一下，一般术中损伤视网膜血管会立刻出血，此刻建议剔除。术后发现晶体全白了，不要担心，2-3 h 以后你会发现他们全部恢复了。一般晶体损伤的话在术中可以发现，术后逐渐出现局限的混浊。
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